Спосіб діагностики нирково-клітинного раку за допомогою молекулярного біомаркера мікрорнк–15a в сечі

Реферат: Спосіб діагностики нирково-клітинного раку за допомогою молекулярного біомаркера включає визначення експресії генетичного молекулярного біомаркера. Додатково проводять виділення РНК, зворотну транскрипцію та полімеразну ланцюгову реакцію у реальному часі для визначення експресії молекулярного біомаркера мікроРНК-15а в сечі. За отриманими показниками проводять діагностику нирково-клітинного раку і визначають ступінь диференціації пухлини. UA 120859 U (12) UA 120859 U UA 120859 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі медицини, зокрема урології, і може бути застосована для підвищення точності діагностики нирково-клітинного раку. Нирково-клітинний рак (НКР) є найбільш розповсюдженою первинною пухлиною нирки, що зустрічається у 3 % випадків всіх злоякісних новоутворень і у 90 % випадків злоякісних пухлин нирки [Pierorazio Phillip M., Michael H. et al. Management of Renal Masses and Localized Renal Cancer: Systematic Review and Meta-Analysis. The Journal of Urology. № 4. Vol. 196. 2016. P. 98999]. Ефективність застосування черезшкірних пункційних біопсій (ЧПБ) для діагностики НКР на даний момент активно дискутується, оскільки дана методика є інвазивною, а частка неінформативних ЧПБ нирки варіюється від 5 до 40 % [Blute Michael, Joel Prince, Eric Bultman et al. Predictors of non-diagnostic renal mass biopsy. The Journal of Urology. 2015. № 4. Vol.193. P. 532-533]. Водночас, чутливість променевих методів обстеження, таких, як комп'ютерна томографія чи магнітно-резонансна томографія у діагностиці цієї патології не перевищує 8696 %, а достовірна диференціація НКР та доброякісних пухлин нирки - онкоцитоми, папілярної аденоми та ангіоміоліпоми з низьким вмістом жиру - взагалі неможлива [Zhang Hanmei, Qi Gan, Yinghua Wu et al. Diagnostic Performance of Diffusion-Weighted Magnetic Resonance Imaging in Differentiating Human Renal Lesions (Benignity or Malignancy): A Meta-Analysis. Abdominal Radiology. N10. Vol. 41. 2016. P. 1997-2010]. Особливі труднощі виникають при постановці діагнозу у хворих з малими нирковими новоутворами (SRM, small renal masses) розмірами до 4 см, при яких, як вказують результати післяопераційного патоморфологічного аналізу, 7,5-33,6 % парціальних нефректомій при підозрі на злоякісний процес виконуються за наявності доброякісної пухлини нирки [Kim See Hyung, Chan Sun Kim, MiJeong Kim et al. Differentiation of Clear Cell Renal Cell Carcinoma From Other Subtypes and Fat-Poor Angiomyolipoma by Use of Quantitative Enhancement Measurement During Three-Phase MDCT. American Journal of Roentgenology. N1. Vol. 206. 2016. P. 21-28]. На даний момент активно вивчається роль мікроРНК (miR) у розвитку злоякісних пухлин та можливість їх застосування у якості біомаркерів раку методом вивчення їх експресії у тканинах та рідинах хворих. В останні роки було проведено ряд досліджень по вивченню експресії мікроРНК при НКР. Було визначено, що середнє значення експресії мікроРНК-508-3р в крові хворих із НКР є достовірно нижчим, ніж у хворих із доброякісними пухлинами нирок та у здорових осіб: 7,33 умовних одиниць (У О), 22,27 УО та 23,15 УО відповідно [Строй О.О., Банира О.Б., Шуляк О.В. Цінність Мікро-РНК-508-3р у діагностиці раку нирки. Український Медичний Часопис. № 2. 2012. С. 1-3]. В інших дослідженнях були наведені дані щодо абнормальної експресії окремих мікроРНК у хворих із НКР, а саме miR-27, miR-28, miR-30c, miR-106b, miR-135a, miR-141, miR-185, miR-199a, miR200c, miR-210, miR-451, miR let-7f-2, проте отримані результати нерідко взаємно суперечать, а рівні експресії мікроРНК інколи виміряні лише в тканинах пухлини вже після її видалення [Vergho Daniel, Susanne Kneitz, Andreas Rosenwald et al. Combination of Expression Levels of miR21 and miR-126 Is Associated with Cancer-Specific Survival in Clear-Cell Renal Cell Carcinoma. BMC Cancer. 2014. N14 (25). P. 1-10]. На сьогоднішній день, згідно з Рекомендаціями Європейської Асоціації Урології, не існує жодного молекулярного біомаркера, який би міг застосовуватись у широкій клінічній діагностичній практиці при вказаній патології. Існують дані щодо важливого значення miR-15а у патогенезі раку простати, хронічної лімфоцитарної лімфоми та аденоми гіпофізу, при яких вона відіграє роль туморосупресора, промотуючи апоптоз злоякісних клітин, маючи за мішень онкоген BCL2. MiR-15a походить з кластеру хромосомної ділянки 13q14, яка часто делетована при злоякісних новоутвореннях [Teixeira Ana L., Marta Ferreira, Joana Silva et al. Higher Circulating Expression Levels of miR-221 Associated with Poor Overall Survival in Renal Cell Carcinoma Patients. Tumour Biology. N5 (35). 2014. P. 4057-66]. У даний момент не виникає сумніву у необхідності пошуку молекулярних біомаркерів нирково-клітинного раку, визначення яких би дозволяло без інвазивного втручання проводити діагностику цього захворювання, встановлювати гістологічний підтип та ступінь диференціації пухлини і при цьому уникати променевого навантаження на хворого. Найближчим аналогом пропонованої корисної моделі є спосіб діагностики і лікування злоякісної пухлини з використанням антитіла проти EREG шляхом визначення підвищеної експресії гена і білку EREG при раку нирки та інших злоякісних пухлинах - раку товстого кишечнику, аденокарциноми легень, раку підшлункової залози та раку шлунка [Патент РФ № 2537245 С2, МПК А61K 39/395, А61Р 35/00, опубл. 27.12.2014]. Спільною ознакою найближчого аналога та корисної моделі, що заявляється, є те, що в обох випадках проводять визначення експресії генетичного молекулярного біомаркеру, на основі визначення рівню якого проводять діагностику НКР. Проте, найближчий аналог дозволяє 1 UA 120859 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 визначати експресію EREG лише в отриманих зразках тканини, для чого необхідне інвазивне втручання - ЧПБ, та не передбачає визначення ступеня диференціації пухлини. В основу корисної моделі поставлена задача створити неінвазивний спосіб діагностики нирково-клітинного раку за допомогою молекулярного біомаркера мікроРНК (міРНК), що дозволить оцінити його експресію в хворих із НКР, а також визначати ступінь диференціації злоякісного процесу. Поставлена задача вирішується тим, що у способі діагностики нирково-клітинного раку за допомогою молекулярного біомаркера, що включає визначення експресії генетичного молекулярного біомаркера, згідно з корисною моделлю, проводять виділення РНК, зворотну транскрипцію та полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) у реальному часі для визначення експресії молекулярного біомаркера міРНК-15а в сечі та за отриманими показниками проводять діагностику НКР і визначають ступінь диференціації пухлини. Заявлена корисна модель базується на дослідженні, яке дозволяє вперше неінвазивним методом за допомогою зворотної транскрипції та ПЛР проводити визначення експресії молекулярного біомаркера мікроРНК-15а в сечі хворих із підозрою на НКР, диференціювати злоякісні і доброякісні пухлини нирок та встановлювати ступінь диференціації нирковоклітинного раку за класифікацією Furhman. Спосіб, що заявляється, здійснюють таким чином. У хворого із НКР за 1 день до нефректомії та на 8-й день після неї в стерильний контейнер збирають ранішню сечу в об'ємі 100-150 мл, при потребі - з подальшою кріоконсервацією при 25 °C. Визначення експресії міРНК-15а у сечі проводять в декілька етапів. Виділяють тотальну РНК за допомогою набору mirVana™ miRNAIsolationKit (AppliedBiosystems, США) у відповідності до протоколу виробника. Визначають концентрацію РНК із використанням спектрофотометра (NanoDrop ND1000, NanoDrop Technologies Inc, США). Проводять визначення мікроРНК методом зворотної транскрипції та ПЛР у реальному часі: зворотну транскрипцію виконують, застосовуючи набір TaqManMicroRNAReverseTranscriptionKit (AppliedBiosystems, США), специфічний праймер для мікроРНК та 10 нг тотальної РНК; кількісну ПЛР у реальному часі проводять з використанням TaqManMicroRNAAssays (AppliedBiosystems, США): U6 snRNA, ID 001973 (як ендогенний контроль), hsa-miR-15a, ID 000389 (AppliedBiosystems, США). Температурні цикли наступні: крок ініціальної денатурації 95 °C 10 хв.; 50 циклів 95 °C-15 с та 60 °C-60 с. Рівень експресії miRNA нормалізують до U6 snRNA, представлений в умовних ΔCt 100 одиницях (2 * , УО). Ампліфікацію проводять на "7500 FastReal-time PCR" (AppliedBiosystems, США). Отримані результати аналізують за допомогою програмного забезпечення "7500 FastReal-time PCR", відображення результатів - за допомогою графіків. Отримані рівні експресії міРНК-15а у хворих із підозрою на НКР дозволяють проводити диференційну діагностику злоякісного процесу шляхом порівняння значення експресії із її референтним значенням у здорових осіб, а також у хворих із доброякісними пухлинами нирок: у хворих із НКР рівні експресії міРНК-15а достовірно вищі (р