Спосіб діагностики порушень фертильності в чоловіків

Реферат: Спосіб діагностики порушень фертильності в чоловіків включає визначення активності ферменту та розрахунок питомої активності на кількість сперматозоїдів в 1 мл еякуляту. Як фермент використовують -глутамілтранспептидазу. При питомій активності, вищій ніж 0,363 нкат/млн сперматозоїдів, діагностують значне порушення фертильності. При питомій активності, вищій ніж 10,3 нкат/млн сперматозоїдів, - відсутність фертильності еякуляту. UA 122056 U (54) СПОСІБ ДІАГНОСТИКИ ПОРУШЕНЬ ФЕРТИЛЬНОСТІ В ЧОЛОВІКІВ UA 122056 U UA 122056 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, а саме - клінічної лабораторної діагностики, та може бути використана як біохімічний маркер фертильності еякуляту. Існує багато способів діагностики порушень фертильності у чоловіків, серед яких можна виділити цитологічні, біохімічні, імунологічні та ін., але їх основними недоліками є те, що вони трудомісткі, довготривалі і не відображують етіопатогенез конкретної форми безпліддя. Відомий біохімічний спосіб діагностики фертильності - визначення активності -глікозидази в спермоплазмі еякуляту [Долгов В.В, Луговская С.А., Фанченко Н.Д. и др. Лабораторная диагностика мужского бесплодия. -М-Тверь: "Триада", 2006. - С. 133-134]. Спосіб включає дослідження еякуляту: центрифугування при 1000 g протягом 10 хвилин, відбір сім'яної плазми. Піпеткою переносять у пробірки об'ємом 1,5 мл два зразки по 15 мкл. Також переносять у пробірки по два контрольні зразки, що містять глікозидазу з низькою і середньою активністю і чотири контрольні зразки, що містять глікозидазу з високою активністю. Додають у два контрольні зразки, які містять глікозидазу у високій концентрації, 8 мкл інгібітору кастаносперміну (1 мМ). У кожну пробірку додають по 100 мкл розчину субстрату паранітрофенолу--глікопіранозиду (ПНГП) і інкубують 2 години при температурі + 37 °C. Через 2 години інкубацію зупиняють, додають по 1 мл кольорового реагенту і перемішують. Вимірюють абсорбцію при довжині хвилі 405 нм у планшеті-рідері протягом 60 хвилин. За калібрувальним графіком визначають концентрацію паранітрофенолу (ПНФ), що утворився в зразку (мкМ). 1 (ОД) активності -глікозидази дорівнює продукції 1 мкМ ПНФ за 1 хвилину інкубації при температурі +37 °C. Спільною суттєвою ознакою аналога і корисної моделі, що заявляється, є те, що проводиться біохімічне дослідження еякуляту. Проте, цей спосіб є недостатньо ефективним, оскільки, потребує наявності дорогого обладнання (планшетний рідер) та реактивів фірми Sigma, і є трудомістким. Результати аналізу відображують великою мірою функціональний стан придатків яєчка, і тому не відображують вплив інших етіопатогенетичних факторів. Найбільш близьким до корисної моделі, що заявляється, є метод визначення активності акрозину, у якому проводиться розрахунок активності на кількість сперматозоїдів в 1 мл [В.А. Патько, Н.Г. Грищенко, В.В. Лазуренко. Порівняльна характеристика методів підготовки сперміїв до програми штучної опсемінації. - Жіночий лікар. - № 4. - 2007. - С. 30]. Для визначення активності акрозину в зразках 1 мл еякуляту їх центрифугують при швидкості центрифуги в 400 обертів протягом 10 хвилин. Піпеткою відбирають надосад і до решти додають 5 мл 0,14 М KСl. Повторно центрифугують при швидкості центрифуги в 4000 обертів протягом 10 хвилин. В одержаний осад додають 3 мл натрій-фосфатного буфера рН 7,4 з 0,5 %-м тритоном Х-1000, ретельно ресуспендують і визначають концентрацію сперміїв. Для екстракції ферменту пробірки із суспензією клітин залишають на 3 години при кімнатній температурі і періодично струшують. Після інкубації зразки центрифугують при швидкості центрифуги в 400 обертів протягом 10 хвилин. Активність акрозину визначають у надосадовій рідині. У пробірку наливають 1 мл робочого розчину казеїну і нагрівають при температурі 37 °C протягом 5-10 хвилин. Потім додають 1 мл акросомального екстракту та інкубують 15 хвилин при температурі 37 °C. Для осадження нерозщепленого казеїну реакцію зупиняють додаванням 1 мл 10 %-ї ТХУ. Після цього в контрольну пробірку замість казеїну додають 1 мл фосфатного буфера з рН 8,0, Оптичну щільність визначають на фотометрі КФК-3. За допомогою калібрувального графіку за різницею оптичної щільності дослідних і контрольних проб знаходять концентрацію нерозщепленого казеїну. Активность ферменту визначають за формулою: . . 3 А=(Со-Сх/М Т) 10 , Со - початкова концентрація казеїну, мг/мл; Сх- кінцева концентрація казеїну, мг/мл М - кількість сперміїв, млн./мл; Т - час інкубації акросомального екстракту з розчином казеїну. Спільними суттєвими ознаками прототипу і корисної моделі є те, що проводиться біохімічне дослідження еякуляту та розрахунок активності ферменту на одиницю підрахованих сперматозоїдів. Цей спосіб є недостатньо ефективним, оскільки на результати визначення впливає вміст інгібіторів акрозину, що містяться в спермальній рідині, крім того для виконання дослідження потрібно багато часу. В основу запропонованої корисної моделі поставлено задачу розробити такий біохімічний метод діагностики порушень фертильності, який надавав би можливість відобразити зв'язок 1 UA 122056 U 5 10 15 біохімічних властивостей сперми з порушенням сперматогенезу в чоловіків за умов безпліддя в шлюбі. Поставлена задача вирішується за рахунок того, що в способі діагностики порушень фертильності чоловіків виконується дослідження саме активності ензиму глутамілтранспептидази, що міститься як у самих сперматозоїдах, так і в сім'яній рідині. Суть корисної моделі: для діагностики порушень фертильності в чоловіків визначають активність -глутамілтранспептидази за методом постійного часу за протоколом тест-системи ТОВ НВП "Філісіт-Діагностика" з тією різницею, що сироватка крові змінюється на екстракт гомогенату еякуляту. При питомій активності, вищій за 0,363 нкат/млн сперматозоїдів, діагностують значне порушення фертильності, а при питомій активності, вищій ніж 10,3, відсутність фертильності еякуляту. Спосіб здійснюють таким чином: Активність визначається за методом постійного часу за протоколом тест-систем ТОВ НВП "Філісіт-Діагностика" в нашій модифікації, згідно з якою сироватка крові замінена на екстракт гомогенату еякуляту. Аналіз проводять за схемою: Калібрувальна проба Робочий субстратний розчин 1,0 1,0 1,0 Інкубують 5 хв при температурі + 37 °C Екстракт гомогенату 0,10 еякуляту Інкубують 15 хв при температурі + 37 °С Калібратор 0,05 Розчин оцтової кислоти 6,00 6,00 6,00 Екстракт гомогенату 0,10 еякуляту Дистильована вода 0,05 Відміряти в пробірку, мл Дослідна проба Холоста проба Проба порівняння 1,0 6,00 0,1 Витримують 5 хв при кімнатній температурі. Виміряють оптичну щільність дослідної проби (Едосл.) проти холостої проби, оптичну щільність калібрувальної проби (Екал.) проти проби порівняння. Забарвлення стабільне протягом 30 хв. 20 25 30 35 40 С=(Едосл./Екал.) х 3 нкат/мл, де С - активність -глутамілтранспептидази, нкат/мл; 3 - фактор перерахування, нкат/мл; Едосл - оптична щільність дослідної проби, од. опт. щільності; Екал. - оптична щільність калібрувальної проби, од. опт. щільності. Результати дослідження активності -глутамілтранспептидази (-ГГТ) представляють у вигляді питомої активності -ГГТ (нкат/мл) на одиницю підрахованих сперматозоїдів (млн/мл), тобто нкат/млн сперматозоїдів. Клінічні приклади. Приклад 1 Хворий Т., віком 31 рік. Клінічний діагноз - обстеження. Значення активності -ГГТ 0,13 (нкат/млн сперматозоїдів). За даними сперматограми виявлено: нормоспермію, номозооспермію, нормокінезис, нормальну морфологію і життєздатність сперматозоїдів, ознаки хронічного запалювального процесу. Фертильність еякуляту збережена. Приклад 2 Хворий Б., віком 35 років Клінічний діагноз - обстеження. Значення активності -ГТТ 0,48 (нкат/млн сперматозоїдів). За даними сперматограми виявлено: олігоспермію, нормозооспермію, гіпокінезис, дискінезис, астенозооспермію. Не різко виражена тератозооспермія, бактеріоспермія, грибкове ураження p. Candida. Фертильність еякуляту значно знижена. Приклад 3 Хворий Б., віком 56 років. Клінічний діагноз - обстеження. Значення активності -ГТТ 12,5 (нкат/млн сперматозоїдів). 2 UA 122056 U 5 За даними сперматограми виявлено: олігозооспермію, акінезис, тератозооспермію, зниження життєздатності сперматозоїдів, ознаки хронічного запалювального процесу, бактеріоспермію, трихомонадну і грибкову інфекцію p. Candida. Фертильність відсутня. Таким чином, заявлений спосіб дозволяє визначити об'єктивний показник для діагностики фертильних властивостей еякуляту і підвищити діагностичну якість клінічних обстежень. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 Спосіб діагностики порушень фертильності в чоловіків, що включає визначення активності ферменту та розрахунок питомої активності на кількість сперматозоїдів в 1 мл еякуляту, який відрізняється тим, що як фермент використовують -глутамілтранспептидазу і при питомій активності, вищій ніж 0,363 нкат/млн сперматозоїдів, діагностують значне порушення фертильності, а при питомій активності, вищій ніж 10,3 нкат/млн сперматозоїдів, - відсутність фертильності еякуляту. Комп’ютерна верстка М. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3