Спосіб консервування еритроцитів

Изобретение относится к криобиологии, а именно низкотемпературному консервированию эритроцитов, и может быть использовано на станциях переливания крови. Известен способ криоконсервирования эритроцитов при (-70Н-80)оС с использованием криоконсерванта, содержащего глицерин, маннит, фосфорнокислый натрий и воду бидистиллированную, который добавляют к эритромассе в соотношении 1:1 [1]. Недостатком способа является его трудоемкость, связанная с необходимостью проведения 4-х отмывок, поскольку глицерин является токсичным (DL50=7,35 г/кг при внутрибрюшинном введении крысам 20%-ного раствора [2]). Наиболее близким к заявляемому является способ криоконсервирования эритроцитов, согласно которому к эритромассе в соотношении 2:1 добавляют криоконсервант, содержащий диметилсульфоксид (ДМСО), поливинилпирролидон м.м. 12600 (ПВП-12600), глюкозу, фосфорнокислый натрий, хлористый калий и воду бидистиллированную, после чего замораживают и хранят при умеренно низких температурах. Недостатком способа является то, что он требует больших затрат труда и средств, что связано с использованием больших объемов криоконсерванта по отношению к эритромассе. Кроме этого в способе используется токсичный препарат ДМСО (DL50 = 12,9 г/кг при внутрибрюшинном введении крысам 25%-ного раствора [4]). В основу изобретения поставлена задача создания такого способа криоконсервирования эритроцитов, в котором путем изменения состава криоконсерванта обеспечивается возможность уменьшения его расхода и за счет этого снижение трудоемкости способа и затрачиваемых на его осуществление средств. Эта задача решается тем, что в способе криоконсервирования эритроцитов, включающем добавление к эритромассе криоконсерванта, содержащего поливинилпирролидон молекулярной массы 12600 (ПВП-12600) и воду бидистиллированную (б/д) с последующим замораживанием и хранением при умеренно низких температурах, криоконсервант дополнительно содержит 1,2-пропанодиол (1,2 ПД), сахарозу и натрия хлорид, причем добавляют его к эритромассе в соотношении (0,3-1): 1 до конечной концентрации 1.2ПД в надосадке 23-42%, а компоненты берут в следующем соотношении, %: Применение криоконсерванта нового состава позволяет использовать его на одну и ту же дозу эритромассы в 3-5 раз меньше, чем в прототипе. В табл. 1 приведены объемы растворов, с которыми приходится работать при дозе крови от одного донора 500 мл (250 мл эритромассы). Из табл. 1 видно, что при осуществлении заявляемого способа необходимо работать с меньшими объемами растворов, в связи с чем снижаются в 2-5 раз трудозатраты на приготовление и разлив растворов, обработку и стерилизацию емкостей, загрузку-выгрузку холодильников, стерилизационных камер, транспорта. Соответственно снижаются в затрачиваемые на это средстве. Кроме этого, криоконсервант разработан на основе малотоксичного 1.2ПД (DL50 = 23,4 при внутрибрюшинном введении крысам [2], что снижает ее токсичность [5]. Способ осуществляют следующим образом. Эритроциты центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20-25 мин, удаляют надосадок и к эритромассе в соотношении (0,3-1,0): 1 добавляют криоконсервант, содержащий, % Конечная концентрация 1.2ПД в надосадке после добавления должна составлять 23-42%. Полученную суспензию помещают в электрохолодильник. Отогрев проводят на водяной бане (41-45°С) до комнатной температуры. После отогрева отмывают и переводят в раствор 8е. Πример 1. Эритроциты центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин, удаляли надосадок и к 125 мл эритромассы добавляли 50 мл (1:0,4) криоконсерванта, содержащего, мас.% Конечная концентрация 1.2ПД составляла 27%. Суспензию в полимерном мешке одноразового использования помещали в электрохолодильник. После замораживания до -70°С суспензию размораживали на водяной бане при 45°С. К 175 мл суспензии добавляли 75 мл раствора № 1 и 250 мл раствора № 2. После 10 мин центрифугирования при 1500 об/мин удаляли надосадок и к эритромассе добавляли 375 мл раствора № 2 (1:3). После центрифугирования при 1500 об/мин удаляли надосадок и эритроциты переводили в раствор 8В (1:3). Результаты представлены в табл.2. Из табл.2 видно, что сохранность эритроцитов после криоконсервирования заявляемым способом не ниже, чем в прототипе. Πример 2. Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что криоконсервант добавляли к эритромассе в соотношении 1:1 при следующем соотношении компонентов, % После отмывки общие потери составили 11,4 ± 1,6%, гемолиз в растворе 8е через 24 ч-1,0 ± 0,1%. Πример 3. Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что криоконсервант добавляли 1:1 при следующем соотношении компонентов, % После отмывки общие потери 58,0 4,0%, в суспензии много стромы. Таким образом если компоненты среды брать в количествах, ниже заявляемых, резко увеличиваются потери клеток. Πример 4. Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что криоконсервант добавляли 0,5:1 при следующем соотношении компонентов, % После отмывки общие потери - 11,4± ± 0,5%, гемолиз в растворе 8В через 24 часа -0,6+0,1%. Πример 5. Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключение того, что криоконсервант добавляли 0,5:1 при следующем соотношении компонентов, % После отмывки общие потери 14,5± ± 1.5%, гемолиз в растворе 8В через 24 ч 0,7 ±0,1%. Поскольку увеличение содержания любого компонента среды, приведенной в примере 4, на 1 г приводит к потере растворимости, содержание сахарозы было увеличено за счет уменьшения количества ПВП. Таким образом максимальные количества компонентов криоконсерванта определяются их растворимостью. Πример 6. Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что изменяли конечную концентрацию 1,2ПД в надосадке, которую определяли методом Н-ЯМР (точность определения ± 0.1%). Результаты представлены в табл.3. Из табл. 3 видно, что при концентрациях 1.2ПД в надосадке выше 42% и ниже 23% эритроциты теряют свою полноценность и не пригодны для переливания. Пример?. Для проверки влияния неконтролируемого размораживания на сохранность эритроцитов проводили трехразовое циклирование температуры (-30)-('85)оС при различных количествах ПВП, минимальной (35%) концентрации 1.2ПД. Содержание сахарозы - 2%, NaCI -0,6%. Результаты представлены в табл.4. Из табл.4 видно, что возможные случайные отогревы холодильника мало влияют на сохранность эритроцитов. Пример 8. Способ осуществляли аналогично примеру 1. Эритромассу хранили в холодильнике в течение 10 мес. в гема-коновских полимерных мешках. После отогрева и отмывки общие потери составили 10,9 ± 1,6%. Гемолиз в растворе 8В через 24ч-0,8 ±0,2%. Остаточный 1.2ПД меньше 0,1%. Эритроциты имели нормальную форму и более 90% клеток образовывали монетные столбики, поглощали кислород.