Спосіб визначення рівня активності та стабільності інгібіторів трипсину в сиворотці крові і пристрій для його здійснення

Винахід відноситься до галузі медицини, зокрема до клінічної лабораторної діагностики гострих та хронічних запальних процесів, обумовлених порушенням інгібіторної активності і вимагаючих її корекції. Відомий спосіб визначення інгібіторів трипсину в сироватці крові (Веремєєнко К.Н., Голобородько О.П., Кизим А.И. Протеолиз в норме и при патологии. - К.: Здоров'я, 1988. - С.174 - 175), який полягає в тому, що на засвічену, проявлену та закріплену рентгенівську плівку наносять по краплі суміші різної концентрації трипсину з сироваткою крові і інкубують на протязі 20хв. при кімнатній температурі. Після цього плівку промивають дистильованою водою і вираховують зони лізісу (протеолізу), які утворилися після дії комплексу трипсин-інгібітор. Вміст інгібіторів трипсину в 1л сироватки крові визначають середньоарифметичним значенням концентрації розчину трипсину від'ємного результату (відсутність зони розчинення) лізісу (желатинової поверхні рентгенплівки) та першого позитивного результату (наявність зони просвітлення плівки) з переведенням на грами інактивованого трипсину. Недоліком способа є те, що неможливо оцінити інгібіторну стабільність на протязі доби, тому що крапля, яка наноситься на рентгенплівку, вже через 6 - 8 годин висихає і таким чином припиняються умови для нормального ферментативного процесу трипсину. Відомий пристрій для визначення чутливості мікробів до антибіотиків та їх сполученням (Лабораторное дело. - 1974. - №1. - C.288 - 290), який складається з чотирьохкутної пластмасової пластини з лунками, які вміщують по 0,1мл рідини. Конструкція лунок така, що не дозволяє розміщувати в них диски в діаметрі 10мм як це передбачається запропонованою методикою і тому використання цього пристрою є неможливим. В основу винаходу поставлене завдання удосконалення способу визначення рівня активності та стабільності інгібіторів трипсину в сироватці крові і створення пристрою для його здійснення, в якому використовується молочно-агарове середовище в оптимальному співвідношенні "голодного" агару і обезжиреного молока (1 : 1), диски з фільтрувального паперу в діаметрі 10мм та сконструйований пристрій для проведення цих досліджень, чим забезпечується можливість вимірювання активності інгібіторів на протязі доби і таким чином є можливим визначити не тільки кількісно, але і виявити якісні зміни в інгібіторній активності, інгібіторно-протеазний дисбаланс, їх швидке виснаження, і за рахунок цього буде сприяти покращанню діагностики гострих та хронічних запальних процесів, обумовлених порушенням інгібіторної активності, та вибору лікувальних засобів для корекції порушених змін. Поставлене завдання вирішується тим, що в способі визначення рівня активності та стабільності інгібіторів трипсину в сироватці крові, який включає отримання сироватки крові, обробку різної концентрації трипсину сироваткою крові, визначення рівня протеолітичної активності, згідно винаходу, обробляють трипсин різної концентрації сироваткою крові в лунках пристрою, промокнути вмістом лунок диски з фільтрувального паперу накладають на молочно-агарове середовище в чашках Петрі, проводять погодинне вимірювання діаметру зони протеолізу навколо диску в контролі і досліді і по різниці величини визначають рівень інгібіторної активності в мкмоль/л або г/л, потім проводять оцінку інгібіторної активності у здорових і хворих і по відношенню до вихідного рівня здорових і хворих визначають відсотку збереження стабільності інгібіторів. Пристрій для визначення рівня активності інгібіторів трипсину в сироватці крові має лунки в корпусі, згідно винаходу лунки виконані діаметром 1,3 - 1,6см та глибиною 0,8 - 1,2см, корпус обладнаний кришкою та виконаний з фарфору. Пристрій є одним з необхідних елементів до реалізації запропонованого методу. Винахідницький рівень полягає в неочевидності конструкції пластини та лунок і матеріалу з якого виготовляється пристрій. Сукупність вказаних ознак приводить до досягнення мети - визначення рівня активності та стабільності інгібіторів трипсину в сироватці крові. Спосіб здійснюється наступним чином. Готують молочно-агарове середовище в співвідношенні "голодного" агару і обезжиреного молока 1 : 1. Розтоплене молочно-агарове середовище за допомогою стерильного шприца розливають в стерильні чашки Петрі в кількості 10мл і розміщують на горизонтальну поверхню до повного застування. Готові чашки можуть зберегатись при +4°C на протязі 7 днів. Перед використанням їх необхідно підігріти і підсушити. Диски з фільтрувального або хроматографічного паперу в діаметрі 10мм виготовляють відповідним дироколом. Сироватку крові розводять в 4 рази трис-буферним розчином з pH 8,0. На фіг.1 відображено загальний вигляд пристрою з частковим вирізом його стінки для кращого показу конструкції. Як видно з цього малюнку пристрій має корпус 9 в формі кола, діаметром 10см, він містить 8 лунок 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, діаметром 1,5 кожна, та глибиною 1см, 7 по зовні і одна в центрі. На фіг.2 зображена кришка 10 пристрою, виготовлена зі скла, якою прикривається фарфорова пластина. В 8 лунок пристрою вносять по 0,1мл розчину кристалічного трипсину різної концентрації (0,125; 0,25; 0,375; 0,5; 0,625; 0,75; 0,875; 1мг в 1мл) і по 0,1мл розведеної в 4 рази трисбуфером сироватки крові. Легкими рухами пристрою перемішують вміст лунок і залишають на 15хв. при температурі +20 ... 22°C до створення комплексу трипсину з сироватоними інгібіторами. Потім в лунки кладуть диски з фільтрувального або хроматографічного паперу до промокнення. Після цього диски за допомогою пінцету накладають на поверхню молочно-агарового середовища на однаковій відстані один від одного і на 2см від краю чашки. На чашку Петрі розташовують 8 дисків - 7 по зовні та один - в центрі. Одночасно ставлять контроль, де на чашку кладуть 8 дисків промокнутих згаданими вище концентраціями трипсину. Обидві чашки (проба і контроль) розміщують в термостаті при температурі 37°C. Результати відмічають, починаючи з 30-ти хвилинного перебування в термостаті, шляхом вимірювання за допомогою лінійки діаметру зони просвітлення навколо диску, включаючи діаметр самого диску, яка розглядається як зона протеолізу, величина її діаметру, як показують дослідження, залежить від концентрації трипсину, та часу його взаємодії з середовищем. По різниці діаметру зони протеолізу в контролі і пробі через 30хв., годину... і на протязі доби дає можливість легко вирахувати кількість трипсину зв'язаного з сироваткою крові і таким чином встановити величину інгібіторної активності в залежності від часу інкубації та отримати уяву про стабільність і тривалість інгібуючої активності сироватки крові за добу. Приклад 1. Отриману сироватку крові від хворих або здорових досліджують за вище вказаною методикою. Діаметр зони протеолізу в пробі, в якій трипсин реагував в присутності сироватки, склав 10мм, де знаходилось 50мкг трипсину, а в контролі такий же діаметр зони протеолізу стався з кількістю 12,5мкг трипсину в пробі, то концентрація трипсину, який зв'язався з інгібітором буде складати 50 - 12,5 = 37,5мкг. Виходячи з того, що 1 моль трипсину взаємодіє з 1 моль інгібітору, вміст інгібітору трипсину розраховують за формулою де 37,6 - кількість зв'язаного трипсину, мкг; 4 - коефіцієнт розведення сироватки; 0,1 - кількість розведеної сироватки в пробі; 1000 - коефіцієнт перерахунку на 1л плазми; 24000 - питома вага трипсину. Приклад 2. Виходячи з даних попереднього прикладу. Активність інгібіторів можна розрахува ти в грамах інактивованого трипсину в 1л цільної сироватки за формулою де 37,5 - кількість зв'язаного трипсину, мкг; 4 - коефіцієнт розведення сироватки; 1000 - коефіцієнт перерахунку на 1л плазми; 0,1 - кількість розведеної сироватки в пробі, мл; 1000000 - коефіцієнт до переводу в грами. Таким чином, 1л даного зразку цільної сироватки здатний інактивувати 1,5г трипсину. В табл.1 представлені порівняльні дані вмісту сироваточних інгібіторів трипсину у здорових і у хворих з різними формами гострого панкреатиту, отриманих запропонованою методикою. За допомогою запропонованої методики є можливим отримати не тільки вихідну інформацію про інгібіторну активність сироватки крові, але і отримати уяву про стабільність та тривалість інгібуючої активності сироватки крові на протязі доби, чого неможливо зробити за допомогою методики К.Н. Веремєєнко, тому що крапля, яка наноситься на рентгенівську плівку, вже через 6 - 8 годин висихає і таким чином припиняються умови для нормальної ферментативної дії трипсину. Динаміка інгібіторно-протеазного комплексу на протязі доби характеризується мінливістю. На основі отриманих результатів встановлено 4 основні варіанти кривих інгібіторної активності в динаміці, які представлені на фіг.3: 1. Крива динамічної рівноваги інгібіторно-протеазного комплексу, яка характеризується помірним вихідним рівнем інгібіторної активності (по відношенню до показників, отриманих при дослідженні різних груп), незначним їх зниженням на протязі першої - другої години інкубації з послідуючою стабільністю на протязі доби. Через добу активність інгібіторів по відношенню до вихідного рівня складає 85, зменшення на 15%. Така динаміка інгібіторної активності спостерігається у здорових людей. 2. Крива компенсаторного інгібіторно-протеазного дисбалансу. Вона характеризується високим вихідним рівнем інгібіторної активності і плавним її падінням на протязі доби. Однак рівень активності через добу знаходиться в межах рівня активності у здорових, або дещо перевищує його, що свідчить про компенсаторні можливості інгібіторів. Така динаміка інгібіторної активності спостерігається у хворих з набряковою формою гострого панкреатиту. 3. Крива декомпенсаторного інгібіторно-протеазного дисбалансу, яка характеризується помірно підвищеним рівнем інгібіторної активності і хвильоподібним її падінням на протязі доби зі зниженням інгібіторної активності до кінця доби на 50 - 70% в порівнянні з вихідним рівнем, що свідчить про значне зниження інгібуючої активності сироватки, та про нестійкість інгібіторно-протеазного комплексу. Така картина спостерігається у хворих з дестр уктивною формою гострого панкреатиту. 4. Крива різкого виснаження інгібіторної активності. Вона характеризується помірним вихідним рівнем інгібіторної активності і різким її падінням на протязі 6 - 12 годин інкубації. До кінця доби у цієї категорії хворих активність інгібіторів стає нульовою, що свідчить про різке виснаження інгібіторної активності сироватки крові. Ця картина спостерігається у хворих з прогресуючим перебігом деструктивного панкреатиту та летальними наслідками. Таким чином, запропонована методика дозволяє не тільки визначити інгібіторну активність сироватки крові, але і оцінити якісні зміни в інгібіторній активності, виявити інгібіторно-протеазний дисбаланс, виснаження інгібіторної активності сироватки крові. За допомогою запропонованої методики є можливим оцінити інгібіторну активність тих чи інших речовин на протязі доби. Оскільки погодинне вимірювання інгібіторної активності на протязі доби є не зручним. то в практичному відношенні динаміку інгібіторно-протеазного комплексу за добу можна легко оцінити по рівню збереження, або зниження активності інгібіторів по відношенню до їх ви хідного рівня і в порівнянні зі здоровими, що представлено на табл.2. Як видно з представлених даних, збереження інгібуючої активності через добу у здорових, по відношенню до вихідного рівня склало 85%, у хворих з набряковою формою гострого панкреатиту - 44,2%, але по відношенню до рівня збереженої активності у здорових вона склала 101,4%, що свідчить про достатні компенсаторні можливості інгібіторів сироватки крові. У хворих з дестр уктивною формою гострого панкреатиту вихідний рівень інгібуючої активності складав 66,6 ± 3,75мкмол, що на 26,6% перевищував його у здорових, але через добу рівень збереження інгібуючої активності по відношенню до вихідного рівня склав 12,4, а по відношенню до збереження активності здорових - 17,4%. Ці дані вказують на різке порушення інгібіторної системи, нестабільність інгібіторно-протеазного комплексу та виснаження інгібіторної активності сироватки крові.