Техпроцес діагностики коротковузля винограду

Техпроцес діагностики коротковузля винограду у верхівках зелених пагонів з листям, коренях та здерев'янілих пагонах винограду шляхом полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскрипцією, який полягає в тому, що рослинний матеріал гомогенізують у екстракційному карбонатному буфері, утворену суспензію додають до екстракційного гліцинового буфера, протягом 10 хвилин суміш прогрівають при 95°С, витримують зразки на льоду 3 години, а потім аналізують за допомогою тест-набору об'ємом 25мкл складом 2,5мкл десятикратного буфера для проведення полімеразної ланцюгової реакції, 2,5мкл обважчувача (20% цукроза), 1мМ крезолового червоного, 200мкМ кожно U 2 (19) 1 3 18218 4 пошириться на значні площі насаджень через пезелених пагонів з листям і здерев'янілі пагони та реносники інфекції. корені. Проводять пробопідготовку, для чого відВнаслідок викладеного, виникає задача розважують 100мг рослинного матеріалу, поміщають робки техпроцесу діагностики коротковузля у позразок у стерильну ступку і заливають 2мл екстрасадковому матеріалі зі 100% вірогідністю. кційного карбонатного буфера (Na2CO3 - 1,59г; Досягнутий рівень в області технологій діагноNa2HCO3 - 2,93г; полівінілпіролідон з молекулярстики коротковузля характеризується наступними ною вагою 40000 - 20,0г; бичачий сироватковий прикладами. альбумін - 2,0г; Твін-20 - 0,5мл; Na2S2O5 -10,0г; Відомий техпроцес діагностики коротковузля, рН9,6). Стерильним товкачиком ретельно гомогеописаний в [Martelli G.P. Use of herbaceous hosts нізують рослинну тканину. До 25мкл екстракційно//Graft-transmissible diseases of grapevines: го гліцинового буфера (NaCl - 2,92г; гліцин - 7,5г; Handbook for detection and diagnosis. -Rome: FAO, ЕДТА - 0,379г; Тритон Х-100 - 5мл, рН9,0) додають 1993. -P.157-162], заснований на методі заражен2мкл утвореної суспензії і протягом 10 хвилин суня трав'янистих рослин-індикаторів. Техпроцес міш прогрівають у твердотільному термостаті при складається з наступних технологічних операцій. 95°С. Після цього зразки витримують на льоду 3 Тест-рослини видів Chenopodium quinoa і години (Habili N., особисте повідомлення). ОтриChenopodium amaranticolor вирощують в теплиці ману суспензію аналізують за допомогою тестнабору об'ємом 25мкл складом 2,5мкл десятикрапри температурі +20 С +22 С до стадії 6-8 справтного буфера для проведення ПЛР (0,5М КСl; 0,1М жніх листків. Верхнє листя рослин винограду, які Трис-НСl, рН9,0), 2,5мкл обважчувача (20% цукропотрібно перевірити на наявність віруса короткоза), 1мМ крезолового червоного, 200мкМ кожного з вузля, подрібнюють у буфері та натирають отри4 дезоксинуклеозидтрифосфатів, 0,1М дитіотриеманим гомогенатом листя тест-рослин, посилане тола, 0,5мкМ кожного праймера (oligoC1 і oligoV1), абразивним порошком. За симптомами спостері1,25Од Taq-полімерази ("Promega", США), 8Од гають впродовж 7-15 днів. Недоліком техпроцесу ревертази ("Gibko", США), 1,5мМ сульфату магнію. діагностики коротковузля методом зараження траПісля внесення зразка у тест-набір у твердотів'янистих тест-рослин є істотні витрати часу, необльному термостаті проводять зворотну транскрипхідного для прояву симптомів. цію при 52°С напротязі 30 хвилин. Після зворотної Існує серологічний метод діагностики короткотранскрипції проводять ампліфікацію, не замінюювузля, описаний в [Garnsey S.M., Cambra M. чи реакційної суміші. Ампліфікація включає 35 циEnzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) //Graftклів чергування денатурації при 94°С напротязі transmissible diseases of grapevines: Handbook for 30сек, відпалу при 56°С напротязі 45сек, елонгації detection and diagnosis. -Rome: FAO, 1993. -P.169при 72°С напротязі 60сек, а в останньому циклі час 192 та також в Boscia D., Digiaro M., Fresno J. et al. елонгації сягає 7 хвилин. Потім за допомогою елеELISA for the detection and identification of grapevine ктрофорезу у 1,5% агарозному гелі проводять viruses //Sanitary selection of the grapevine: аналіз продуктів ампліфікації. Крім зразків, що тесProtocols for detection of viruses and virus-like туються, в агарозний гель вносять маркери молеdiseases. -Paris: INRA, 1997. -P.128-155]. Першим кулярної ваги. За розміром ампліконів, що світятьетапом даного техпроцесу діагностики є фізичне ся в ультрафіолетовому світлі після фарбування зв'язування первинних антитіл до антигенів віруса ДНК бромистим етидієм, судять про наявність або коротковузля (поліклональних кролячих) на лунках відсутність патогена у зразку. Для пари праймерів мікропланшети із полістиролу. Далі сорбуються oligoC1 і oligoV1 розмір амплікона становить 321 послідовно антиген віруса, який виявляють, та пару основ. У випадку, якщо амплікони відсутні, вторинні антитіла (кон'юговані поліклональні антизразок не містить віруса коротковузля. кролячи), до складу яких введена ферментна мітка Недоліком відомого техпроцесу є недостатня (лужна фосфатаза). вірогідність діагностики коротковузля, яка дорівОстаннім етапом є внесення субстрата (рнює 87%. Недостатня вірогідність діагностики монітрофенілфосфату) та інкубація 60 хвилин у темже призвести до того, що посадковий матеріал ряві. Інтенсивність забарвлення зразка прямо пробуде частково інфікований вірусом коротковузля. порціональна кількості антигена у дослідженому В Україні в залежності від регіону культивування рослинному матеріалі. Недоліком даного техпролатентна інфікованість винограду вірусом коротцесу діагностики коротковузля є неможливість ковузля коливається від 2,3% до 19%. У місцевосцілковитого виключення хибнопозитивних результях, де поширений переносник коротковузля - нетатів (вірогідність складає 90%). матода Xiphinema index, висадка інфікованого Одним із найчутливіших і найспецифічніших матеріалу призводить до поступового розповсюметодів діагностики є полімеразна ланцюгова реадження збудника на здорових ділянках, що веде за кція зі зворотною транскрипцією (ЗТ-ПЛР). Відособою значне зниження врожайності. мий найбільш близький за сукупністю суттєвих Розробка нового більш надійного техпроцесу ознак до заявленого техпроцес діагностики коротдля діагностики коротковузля винограду проводиковузля, описаний в [Rowhani A., Biardi L., Johnson лась кафедрою мікробіології і вірусології ОдеськоR. et al. Simplified sample preparation method and го національного університету. one-tube RT-PCR for grapevine viruses //Proc. XIIIth В основу корисної моделі поставлена задача ICVG Meeting (Adelaide, Australia, 12-17 March підвищити вірогідність діагностики коротковузля до 2000). -Adelaide, 2000. -P.148 (прототип)]. Взятий у 100%. Ця задача вирішується шляхом використанякості прототипа техпроцес складається з наступня пропонуємого техпроцесу, у якому змінено паних технологічних операцій. Для тестування на раметр операції відпалу - температура відпалу наявність віруса коротковузля відбирають верхівки 5 18218 6 підвищена до 61°С замість 56°С у прототипа, а гліциновому буфері напротязі 10 хвилин і витримтакож змінено концентрацію одного з компонентів ка зразків на льоду 3 години; тест-набору, а саме - концентрацію сульфату маг2. Тестування підготовлених зразків методом нію зменшено з 1,5мМ у прототипа до 1,3мМ. ЗТ-ПЛР; Пропонуємий техпроцес діагностики коротко3. Використання тест-набору для діагностики вузля у верхівках зелених пагонів з листям, здеревіруса коротковузля об'ємом 25мкл наступного в'янілих пагонах та коренях полягає в тому, що складу: проводять пробопідготовку, для чого відважують - два праймери (0,5мкМ кожного); 100мг рослинного матеріалу, поміщають зразок у - 2,5мкл десятикратного буфера для провестерильну ступку і заливають 2мл екстракційного дення ПЛР (0,5М КСl; 0,1М Трис-НСl, рН9,0); карбонатного буфера (Nа2СО3 - 1,59г; Na2HCO3 - 2,5мкл обважчувача (20% цукроза); 2,93г; полівінілпіролідон з молекулярною вагою - крезоловий червоний (1мМ); 40000 - 20,0г; бичачий сироватковий альбумін - 4 дезоксинуклеозидтрифосфати (200мкМ ко2,0г; Твін-20 - 0,5мл; Na2S2O5 - 10,0г; рН9,6). Стежного); рильним товкачиком ретельно гомогенізують рос- дитіотриетол (0,1М); линну тканину. До 25мкл екстракційного гліциново- 1,25Од Taq-полімерази; го буфера (NaCl - 2,92г; гліцин - 7,5г; ЕДТА - 8Од ревертази; 0,379г; Тритон Х-100 - 5мл, рН9,0) додають 2мкл - сульфат магнію у певній концентрації. утвореної суспензії і протягом 10 хвилин суміш 4. Зворотна транскрипція РНК при 52°С напропрогрівають у твердотільному термостаті при тязі 30 хвилин; 95°С. Після цього зразки витримують на льоду 3 5. Ампліфікація ДНК шляхом чередування дегодини. Отриману суспензію аналізують за допонатурації при 94°С, відпалу при певній температурі могою тест-набору об'ємом 25мкл складом 2,5мкл і елонгації при 72°С впродовж 35 циклів, і в остандесятикратного буфера для проведення ПЛР ньому циклі час елонгації сягає 7 хвилин; (0,5М КСl; 0,1М Трис-НСl, рН9,0), 2,5мкл обважчу6. Аналіз продуктів ампліфікації за допомогою вача (20% цукроза), 1мМ крезолового червоного, електрофорезу в агарозному гелі і оцінка резуль200мкМ кожного з 4 дезоксинуклеозидтрифосфататів діагностики за наявністю ампліконів ДНК ротів, 0,1М дитіотриетола, 0,5мкМ кожного праймера зміру 321 пара основ при освітленні в ультрафіо(oligoC1 і oligoV1), 1,25Од Taq-полімерази ("Амплетовому світлі після фарбування бромистим лиСенс", Росія), 8Од ревертази ("АмплиСенс", етидієм. Росія), 1,3мМ сульфату магнію. Відмінними ознаками пропонуємого техпроцеПісля внесення зразка у тест-набір у твердотісу і прототипа є: льному термостаті проводять зворотну транскрип1. Операцію відпалу при ампліфікації ДНК цію при 52°С напротязі 30 хвилин. Після зворотної проводять при більш високій температурі, яка дотранскрипції проводять ампліфікацію, не замінююрівнює 61°С, замість 56°С у прототипа; чи реакційної суміші. Ампліфікація включає 35 ци2. Концентрація одного з компонентів тестклів чергування денатурації при 94°С напротязі набору, а саме - сульфату магнію - зменшена до 30сек, відпалу при 61°С напротязі 45сек, елонгації 1,3мМ замість 1,5мМ у прототипа. при 72°С напротязі 60сек, а в останньому циклі час Досягнення очікуваного технічного результату елонгації сягає 7 хвилин. Потім за допомогою елепідтверджується наступними прикладами. ктрофорезу у 1,5% агарозному гелі проводять Приклад № 1 аналіз продуктів ампліфікації. Крім зразків, що тесВипробування пропонуємого техпроцесу діагтуються, в агарозний гель вносять маркери моленостики коротковузля винограду і прототипа прокулярної ваги. За розміром ампліконів, що світятьводили з 10.01.2005 по 05.11.2005 в лабораторії ся в ультрафіолетовому світлі після фарбування кафедри мікробіології і вірусології Одеського націДНК бромистим етидієм, судять про наявність або онального університету ім. I.I. Мечникова. Дослівідсутність патогена у зразку. Для пари праймерів джені зразки були відібрані з рослин сорту РупестoligoC1 і oligoV1 розмір амплікона становить 321 рис дю Ло, який є сортом-індикатором щодо пару основ. У випадку, якщо амплікони відсутні, ураження коротковузлям винограду, штучно інфізразок не містить віруса коротковузля. кованих вірусом коротковузля. Інфіковані рослини Технічний результат від використання нового були люб'язно надані доктором D. Boscia (Італія). техпроцесу - 100% вірогідність діагностики, яка Для діагностики коротковузля в рослині виногпроявляється у наявності одиничних чітких смуг раду відбирали верхівки зелених пагонів з листям, ампліконів ДНК певного розміру (321 пара основ) у здерев'янілі пагони і корені. Відважували 100мг випадку тестування усіх зразків рослин, інфіковарослинного матеріалу, який поміщали у стерильну них вірусом коротковузля. Технічний результат ступку і заливали 2мл екстракційного карбонатного досягається підвищеною температурою відпалу буфера (Na2CO3 - 1,59г; Na2HCO3 - 2,93г; поліві(61°С замість 56°С прототипа) і оптимальною коннілпіролідон з молекулярною вагою 40000 - 20,0г; центрацією сульфату магнію (1,3мМ замість 1,5мМ бичачий сироватковий альбумін - 2,0г; Твін-20 прототипа), що запобігає утворенню неспецифіч0,5мл; Na2S2O5 - 10,0г; рН9,6). Стерильним товканих ампліконів. чиком ретельно гомогенізували рослинну тканину. Спільними ознаками прототипа і пропонуємого До 25мкл екстракційного гліцинового буфера (NaCl техпроцесу є наступні: - 2,92г; гліцин - 7,5г; ЕДТА - 0,379г; Тритон Х-100 1. Підготування зразків за допомогою гомоге5мл, рН9,0) додавали 2мкл утвореної суспензії. нізації рослинного матеріалу у екстракційному каНапротязі 10 хвилин суміш прогрівали у твердотірбонатному буфері, прогрівання у екстракційному льному термостаті при 95°С. Після цього зразки 7 18218 8 витримували на льоду 3 години. Отриману суспенпри 72°С напротязі 60сек., а в останньому циклі зію аналізували за допомогою тест-набору об'єчас елонгації сягав 7 хвилин. Потім за допомогою мом 25мкл складом 2,5мкл десятикратного буфеелектрофорезу у 1,5% агарозному гелі проводили ра для проведення ПЛР (0,5М КСl; 0,1М Трис-НСl, аналіз продуктів ампліфікації. Крім зразків, що тесрН9,0), 2,5мкл обважчувача (20% цукроза), 1мМ туються, в агарозний гель вносили маркери молекрезолового червоного, 200мкМ кожного з 4 дезокулярної ваги. За розміром ампліконів, що світятьксинуклеозидтрифосфатів, 0,1М дитіотриетола, ся в ультрафіолетовому світлі після фарбування 0,5мкМ кожного праймера (oligoC1 і oligoV1), ДНК бромистим етидієм, судили про наявність 1,25Од Taq-полімерази ("АмплиСенс", Росія), 8Од віруса коротковузля у зразку. Для пари праймерів ревертази ("АмплиСенс", Росія), 1,3мМ сульфату oligoC1 і oligoV1 розмір амплікона становив 321 магнію. пару основ. У випадку, коли зразок не містив віруПісля внесення зразка у тест-набір у твердотіса коротковузля, амплікони були відсутніми. льному термостаті напротязі 30 хвилин проводили Паралельно проводили порівняльну діагносзворотну транскрипцію при 52°С. Після зворотної тику коротковузля у зразках рослинного матеріалу транскрипції проводили ампліфікацію з тією ж реаза відомим техпроцесом (прототипом), описаним кційною сумішшю. Ампліфікація включала 35 циквище. Результати порівняльного випробування лів чергування денатурації при 94°С напротязі представлені у таблиці 1. 30сек, відпалу при 61°С напротязі 45сек., елонгації Таблиця 1 Залежність вірогідності діагностики коротковузля від використання відомого і нового техпроцесів Вірогідність діагностики коротковузля, % Відомий техпроцес за проПропонуємий техтотипом процес Рослинний матеріал Кількість протестованих зразків Здерев'янілі пагони і корені 50 86 100 Верхівки молодих пагонів з листям 42 88 100 Аналіз результатів багаточисельних порівняльних випробувань вказує на те, що використання нового техпроцесу дозволяє проводити діагностику коротковузля у верхівках зелених пагонів з листям, здерев'янілих пагонах, коренях з вірогідністю, яка складає 100%. Така висока вірогідність за новим техпроцесом зобумовлена чіткими електрофореграмами продуктів ампліфікації, на яких присутні амплікони потрібного розміру (321 пара основ) в усіх повторностях зразків, що містять вірус, і немає смуг неспецифічних ампліконів. Це виключає помилки обліку результатів діагностики. Вірогідність діагностики коротковузля за допомогою прототипа менше, ніж вірогідність діагностики за допомогою нового пропонуємого техпроцесу, і як видно з таблиці, складає від 86 до 88%. Приклад №2 Умови проведення випробувань пропонуємого техпроцесу такі ж, як і у прикладі 1. Операцію відпалу при ампліфікації ДНК проводили при різних температурах: 52°С, 53°С, 56°С, 58°С, 61°С, 64°С. Результати випробувань наведені у таблиці 2. Таблиця 2 Вірогідність діагностики коротковузля при різних температурах відпалу праймерів Температура відпалу, °С 52°С 53°С 56°С 58°С 61°С 64°С Як видно з таблиці 2, вірогідність діагностики дорівнює 100% при використанні температури відпалу 61°С. При температурах відпалу, менших за 61°С, вірогідність зменшується за рахунок появи у низці повторностей смуг неспецифічних ампліконів. Наприклад, при температурі відпалу 56°С згідно з прототипом вірогідність діагностики дорівнює лише 90%. Підвищення температури відпалу більше за 61°С призводить до того, що у низці повторностей не утворюється достатньої кількості продуктів ампліфікації, і вірогідність діагностики Вірогідність діагностики коротковузля, % 85 88 90 95 100 98 коротковузля при використанні температури 64°С дорівнює 98%. Приклад №3 Умови проведення випробувань пропонуємого техпроцесу такі ж, як і у прикладі 1, за виключенням того, що досліджували вплив концентрації сульфату магнію у тест-наборі на вірогідність діагностики. Випробовували такі концентрації сульфату магнію: 1,1мМ, 1,3мМ, 1,5мМ, 1,7мМ, 2мМ. Результати наведені у таблиці 3. 9 18218 10 Таблиця 3 Залежність вірогідності діагностики коротковузля від концентрації сульфату магнію у тест-наборі пропонуємого техпроцесу Концентрація сульфату магнію у тест-наборі пропонуємого техпро- Вірогідність діагностики коротковузля, цесу % 1,1мМ 88 1,3мМ 100 1,5мМ 84 1,7мМ 82 2,0мМ 80 Вірогідність тестування, яка дорівнювала 100%, була досягнута при використанні у тестнаборі концентрації сульфату магнію 1,3мМ. За меншої випробованої концентрації, а саме 1,1мМ, вірогідність тестування зменшувалася до 88% внаслідок утворення недостатньої кількості продуктів ампліфікації у низці повторностей. При концентраціях сульфату магнію, вищих за 1,3мМ, наприклад при 1,7мМ, вірогідність дорівнювала 82%, тому що утворювалися смуги неспецифічних ампліконів, як це видно на кресленні (стрілки Б і В). Стрілка Б вказує на повторності, отримані при ампліфікації зразка за концентрацією сульфату магнію у тест-наборі 1,7мМ, а стрілка В - ампліфікації зразка за концентрацією сульфату магнію у тест-наборі 1,7мМ, а стрілка В - на повторності, отримані за використанням концентрації сульфату магнію 2,0мМ. За концентрацією сульфату магнію Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко 2,0мМ кількість смуг неспецифічних ампліконів зростала. Експериментальні дослідження техпроцесу діагностики коротковузля показали, що сукупність відомих і нових ознак пропонуємого техпроцесу дозволяє вирішити поставлену задачу: підвищення вірогідності діагностики до 100% за рахунок отримання технічного результату - одиничних чітких смуг ампліконів розміру 321 пара основ у випадку тестування усіх зразків рослин, інфікованих вірусом коротковузля. За допомогою пропонуємого техпроцесу діагностики коротковузля винограду з підвищеною до 100% вірогідністю було проведено тестування рослинного матеріалу винограду 8 господарств України і 3 господарств Республіки Молдова. Це забезпечило відбір здорового посадкового матеріалу для закладки насаджень винограду і сприяло підвищенню врожайності виноградників. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601