Полімерний гідрогель біомедичного призначення

1. Полімерний гідрогель біомедичного призначення, що містить ланки гідрофільного мономера і дисперсійне середовище, який відрізняється тим, що додатково містить зшиті ланки гідрофобних 3 20134 деградації, йому властиві й недоліки, що виявляються у цілому ряді робіт. Так, існують труднощі ідентифікації цього природного полімеру: стр уктура колагену, а також відповідно і його властивості, змінюються залежно від конкретного джерела його одержання (див., наприклад, [ЕР 0681846]). Серед інших недоліків покрить на основі колагену слід зазначити його високу ціну, складність виділення й обробки, схильність до заселення хвороботворними мікроорганізмами й неможливість парової стерилізації внаслідок денатурації при підвищених температурах. Крім того, плівкам колагену не притаманна достатня міцність на розрив. Тому використання колагену для загоєння ран і опіків обмежується внаслідок збільшення ризику додаткового інфікування ран, а також можливості імунних реакцій. Для виготовлення синтетичних покрить можуть використовуватись гідрофобні полімери, наприклад, полістирол [Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж. Вудворда. Москва. «Мир». 1988. 215 с.] або кополімер етилену з вінілацетатом [ЕР 0681846]. Є дані про те, що такі гідрофобні полімерні покриття не інгібують ріст клітин різного походження та не володіють цитотоксичністю. Зазначеним покриттям притаманний низький рівноважний водовміст (близько 5-7%), внаслідок чого вони мають підвищену твердість і жорсткість. Проте саме це перешкоджає використанню їх у якості противоопікових покрить, де вкрай важливі протилежні властивості: еластичність, м'якість, здатність відтворювати рельєф рани, а також атравматичність при застосуванні й біосумісність, що збільшується по мірі росту рівноважного водовмісту. Інший гідрофобний двошаровий матеріал на основі поліуретану застосовують для виготовлення тимчасового штучного раневого покриття [JP 6104116 В4]. Матеріал являє собою синтетичний полімерний шар, насичений культуральним середовищем, і шар з клітинами. Недоліком вказаного матеріалу внаслідок його гідрофобності є низька поглинаюча здатність стосовно раневого ексудату. Крім того, внаслідок низької термостабільності, матеріал не витримує термостерилізації, що створює загрозу його заселення мікроорганізмами. Відомо також застосування гідрофільних синтетичних покрить для культивування клітин. Найбільше широко описане застосування гідрогелів на основі поліакриламіду. Найбільш близьким за технічним рішенням є метод одержання поліакриламідного гелю для медико-біологічних цілей, у тому числі й для культивування клітин [SU 977466], який був обраний нами в якості найближчого аналога. Гелеутворення акриламіду здійснюється у фізіологічному розчині, у присутності зшиваючого агента та ініціаторів полімеризації з наступним відмиванням від непрореагованих низькомолекулярних домішок та інкубацією клітинних культур. Отриманий сітчастий полімер не токсичний (за умов якісно виконаного відмивання від токсичних мономерів), має високу еластичність та прозорість. Взагалі, поліакриламідний гель володіє високим рівноважним водовмістом (може досягати значень порядку 95-97%) і, як наслідок, унікальної біосумісністю, 4 однак, його механічна міцність дуже низька [Kondo Т., Muramatsu N. In: Microencapsulation (Nixon J.R., ed), p. 67, Marsel Dekker, Inc., New York, 1976], що не дозволяє використовувати його для виготовлення противоопікових покрить, які, крім забезпечення необхідних умов для культивування клітин, повинні надійно захищати уражену поверхню від інфікування ззовні. Крім того, у випадку недостатньої механічної міцності покриття існує висока ймовірність того, що його дрібні фрагменти із гнійно-некротичними виділеннями залишатимуться на поверхні рани. Варто також підкреслити, що відсутність іоногенних функціональних груп у поліакриламідному гелі обмежує можливість його збагачення елементами культурального середовища та їх тривалого закріплення, що не сприяє якісній іммобілізації клітин на поверхні [Immobilised cells and ensymes. A practical approach. Woodward J., ed IRL Press. Oxford. Washington. 1985]. Крім того, як відомо з літературних даних, здатність поліакриламідного гелю до іммобілізації й пролонгованого вивільнення лікарських речовин украй низька [К.А. Макаров, С.А. Кибардин. Иммобилизованные биопрепараты в медицине. Москва. Медицина. 1980]. Задовільна ефективність іммобілізації досягалася лише у випадку ферментів з високою молекулярною масою, що долають стеричні перешкоди при дифузії крізь часто зшиту макромолекулярну сітку гідрогелю. Однак високий ступінь зшивки в поліакриламідному гелі негативно позначається на культивуванні клітин [Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж. Вудворда. Москва. «Мир». 1988. 215 с.]. З огляду на викладене, використання вказаних гідрогелевих покрить з адресним пролонгованим вивільненням комплексу лікарських препаратів поряд із клітинною терапією не є ефективним. Завданням даної розробки є одержання багатофункціонального гідрогелю медичного призначення, що має оптимальні експлуатаційні характеристики й високий лікувальний ефект стосовно уражень шкіри. Поставлене завдання вирішується шляхом удосконалення структури біосумісного гідрогелю, зміною співвідношення інгредієнтів, додаткового введення в гель культурального середовища й стовбурови х мезенхімальних клітин макроорганізмів у певній концентрації. Гідрогель медичного призначення містить у мас. % зшитого кополімеру на основі гідрофільного мономеру, гідрофобного мономеру, ненасиченої кислоти та біфункціонального мономеру 2,0-70,0 лікарського препарату 0,001-5 культурального середовища з мікрешта до рооб'єктами 100 Одержують його за допомогою кополімеризації гідрофільного мономеру (наприклад, Nвінілпіролідону, 2-гідрооксиетилметакрилату, акриламіду, метакриламіду), гідрофобного мономеру (наприклад, метилакрилату, етилакрилату, метилметакрилату, акрилонітрилу, метакрилонітрилу), ненасиченої кислоти (наприклад, акрилової кисло 5 20134 ти, метакрилової кислоти, кротонової кислоти, 2акриламідо-2-метилпропансульфонової кислоти) та біфункціонального мономеру (наприклад, етиленглікольдиметакрилату, N,N’-метилен-бісакриламіду, 1,4-диакрилоілпиперазину). Зазначений зшитий кополімер одержують при наступних концентраціях комономерів, мас. %: гідрофільний мономер 3,5-60 гідрофобний мономер 0,5-30 ненасичена кислота 0,05-5 біфункціональний мономер 0,001-1 з наступним відмиванням гелю в апірогенній воді, висушуванням, стерилізацією, насиченням культуральним середовищем й нанесенням на його поверхню клітинної суспензії, що містить в 1мл не менш ніж 105 клітин. Отриманий гідрогель набуває властивостей, що притаманні гідрофільним полімерам (підвищена біосумісність, висока поглинаюча здатність по відношенню до раневого ексудату й культурального середовища), а також властивостей, що притаманні гідрофобним полімерам (достатня міцність й зумовлена присутністю в гідрогелевій структурі іоногенних груп здатність зв'язувати та пролонговано вивільняти лікарські препарати). Кополімеризація гідрофобних й гідрофільних мономерів дозволяє досягати того гідрофільногідрофобного балансу, при якому створюються оптимальні умови для культивування клітин (адгезія, розпластування, розмноження, утворення моношару) та забезпечується комплекс необхідних фізико-хімічних властивостей покриття (сорбційна здатність стосовно раневого ексудату, паро- та киснепроникність, міцність, еластичність, атравматичність при застосування). Мікробіологічні дослідження показали, що на гідрофільних поверхнях (наприклад, поверхня гомополіакриламідного гелю) не спостерігається пригнічення росту клітин, однак ні розпластування клітин, ні утворення моношару при цьому не виявлено. У випадку надмірної гідрофобності кополімерного покриття клітини погано прикріплюються до поверхні, крім того, внаслідок непрозорості матеріалу спостереження за ростом клітин та за процесом загоєння рани ускладнюється. Надмірна твердість такого матеріалу не дозволяє виготовляти з нього атравматичні противоопікові покриття. Таким чином, оптимальні експлуатаційні параметри гідрогелевих покрить у поєднанні з найкращими умовами для культивування клітин досягаються саме у випадку застосування помірно гідрофільних і одночасно помірно гідрофобних гідрогелів, що одержуються в процесі кополімеризації гідрофільних і гідрофобних мономерів. Додаткове введення в зазначений кополімерний гідрогель мономерів з іоногенними групами (наприклад, ненасичених кислот) сприяє кращому насиченню покриття культуральним середовищем й закріпленню з наступною пролонгацією вивільнення лікарських засобів, що використовуються при лікуванні опіків та інших уражень шкіри. Тестування гідрогелевих матриць в якості покрить для культивування клітин здійснювали в такий спосіб. Сухі гідрогелеві зразки покрить помі 6 щали в чашки Петрі (фірма "Anumbra", діаметр 35мм) й заливали культуральним середовищем на 5-12 годин для набухання. Потім надлишок рідини видаляли й наносили клітинну суспензію (105 клітин в 1мл культурального середовища). Для приготування клітинних суспензій використовували мезенхімальні стовбурові клітини лінії 4BL2, отримані з периферійної донорської крові. Клітини 4BL2 культивували in vitro у стандартному середовищі ДМЕМ (фірма "Sigma") з додаванням 5% сироватки новонароджених особин великої рогатої худоби (фірма "Sigma"), а також антибіотиків пеніциліну й стрептоміцину по 100ОД/мл. Для одержання клітинних суспензій моношарову культуру на поверхні скляних флаконів або чашок Петрі обробляли розчином трипсину й версену [Бужиевская Т.И., Лукаш Л.Л., Подольская С.В. Экспериментальные модели для изучения мутагенеза и трансформации, индуцированных вирусами и нуклеиновыми кислотами // Методы молекуляр. Биологии. - Киев: Наук. Думка, 1986. - С. 147-158]. В якості контролю клітини висівали на поверхню стандартних чашок Петрі. Інкубацію клітинних культур проводили при температурі 37°С. Спостереження за клітинами проводили під інвертованим мікроскопом щодня протягом тижня. При цьому досліджувалися здатність клітин до іммобілізації на гідрогелевих зразках, агрегація, адгезивні властивості, ріст і розмноження, а також морфологічні властивості. Через добу після посіву клітин на більшості із досліджуваних гідрогелевих зразків спостерігалося прикріплення клітин до поверхні, часткове розпластування, а також утворення агрегатів різної величини (Фіг.1). Лише при використанні помірно гідрофобних і одночасно помірно гідрофільних покрить спостерігалося прикріплення, ефективне розпластування, розмноження й ріст клітин з утворенням моношару (Фіг.2). Надалі суть корисної моделі ілюструється прикладами конкретного виконання. Отримані гідрогелеві зразки покрить аналізувалися за такими показниками, як міцність на розрив, тривалість вивільнення введених хіміотерапевтичних засобів та характер взаємодії клітин та гідрогелевого зразку. Для оцінки швидкості вивільнення лікарських засобів гідрогелеві зразки покрить поміщали в дистильовану воду при температурі 25°С й спостерігали за зміною інтенсивності смуги поглинання в УФ-області, що визначалась з використанням спектрофотометра "SPECORD-M40". Міцність на розрив синтезованих гідрогелів визначали з використанням розривної машини «FP 100/1» (Німеччина). Параметри гідрогелів різної сполуки наведені в Таблиці 1. Приклад 1 В 100мл апірогенної води з температурою 25°С розчиняють 45,0г N-вініл-піролідону (всі використані реактиви - виробництва фірми "Sigma", для біомедичних цілей), 2,5г метилакрилату, 0,5г метакрилової кислоти, 0,2г етиленглікольдиметакрилату, 0,15г персульфату амонію й 0,15г тетраметилетилендіаміну. Отриманий розчин відфільт 7 20134 ровують крізь бактерицидний фільтр із розміром пор 0,45мкм, продувають газоподібним азотом й розливають для проведення полімеризації в плоско-паралельні прес-форми для одержання пластин з товщиною 0,7мм. Прес-форми витримують при температурі 25°С протягом 2-х годин. Потім матеріал виймають із прес-форм і піддають відмиванню в апірогенній воді при температурі 75°С (співвідношення гідрогелю й води 1:3) протягом 7 діб з щоденною заміною води. Гідрогелеві покриття після хроматографічного контролю залишкового вмісту мономерів висушують при температурі 40°С, пакують в полімерну плівку, стерилізують, насичують культуральним середовищем, що містить 5% бактерицидного препарату хлоргексидину біглюконату й наносять клітинну суспензію, що містить 105 клітин в 1мл культурального середовища (процес інкубації клітин описаний вище). Визначали міцність на розрив гідрогелевих покрить, тривалість вивільнення введеного лікарського препарату й спостерігали за характером поводження клітин на поверхні. Результати зведені в Таблицю 1. Приклад 2 В 100г апірогенної води з температурою 25°С розчиняють 90,0г акриламіду, 10г акрилонітрилу, 1г акрилової кислоти, 0,2г Ν,Ν'-метилен-бісакриламіду, 0,1г персульфату калію й 0,125г метабісульфіту натрію. Надалі обробку отриманого гідрогелю здійснюють аналогічно прикладу 1. Використовують культуральне середовище, що містить 5% анестетику лідокаїну гідрохлориду. Визначали параметри, що перераховані в прикладі 1. Результати зведені в Таблицю 1. Приклад 3 В 100г апірогенної води з температурою 25°С розчиняють 70г акриламіду, 30г акрилонітрилу, 2г акрилові кислоти, 1г Ν,Ν'-метилен-біс-акриламіду, 0,05г персульфату амонію й 0,1г метабісульфіту натрію. Надалі обробку отриманого гідрогелю здійснювали аналогічно прикладу 1. Використовують культуральне середовище, що містить 5% 8 анестетику лідокаїну гідрохлориду. Визначали параметри, що перераховані в прикладі 1. Результати зведені в Таблицю 1. Приклад 4 В 100г апірогенної води з температурою 25°С розчиняють 35г акриламіду, 55г акрилонітрилу, 10г метакрилової кислоти, 2г Ν,Ν'-метилен-бісакридаміду, 0,125г персульфату калію й 0,125г 3диметиламінопропіонітрил. Надалі обробку отриманого гідрогелю здійснювали аналогічно прикладу 1. Використовують культуральне середовище, що містить 5% антибіотику лінкоміцину гідрохлориду. Визначали параметри, що перераховані в прикладі 1. Результати зведені в Таблицю 1. Приклад 5 (порівняльний) В 100г апірогенної води з температурою 25°С розчиняють 2,0г акриламіду, 0,1г акрилонітрилу, 0,15г метакрилової кислоти, 0,05г Ν,Ν'-метиленбіс-акриламіду, 0,125г персульфату калію й 0,125г 3-метабісульфіту натрію. Внаслідок низької концентрації комономерів гідрогель не утвориться. Приклад 6 (порівняльний) В 100г апірогенної води з температурою 25°С розчиняють 205г акриламіду, 20г акрилонітрилу, 5г акрилової кислоти, 2,5г Ν,Ν'-метилен-бісакриламіду, 0,125г персульфату калію й 0,125г 3диметиламінопропіонітрил. Внаслідок високої концентрації мономерів спостерігається бурхлива спонтанна вибухоподібна реакція гелеутворення зі вспінюванням суміші й різким погіршенням фізикомеханічних властивостей полімеру. Приклад 7 (порівняльний) Одержують поліакриламідний гель, що містить 11,0% поліакриламіду й 89,0% 0,5%-ного водного розчину хлористого натрію (відповідно до прикладу 1 та найближчого аналога - [SU 977466]). Надалі обробку отриманого гідрогелю здійснюють аналогічно прикладу 1. Використовують культуральне середовище, що містить 5% бактерицидного препарату хлоргексидину біглюконату. Визначали параметри, що перераховані в прикладі 1. Результати зведені в Таблицю. Таблиця Гідрогелевий зразок згідно прикладу Міцність на розрив, Тривалість вивільнення лікарських кПа препаратів, г 1 180 2 245 3 420 4 570 5 (порівняльний) 6(порівняльний) 7 (порівняльний) 125 Характер взаємодії клітин з поверхнею гідрогелевого зразку Клітини розпластуються, прикріплюються до поверхні Клітини розпластуються, прикріплюються 120 до поверхні Клітини розпластуються прикріплюються 134 до поверхні, утворюють моношар Клітини розпластуються прикріплюються 145 до поверхні, утворюють моношар Гель не утворюється Спонтанна вибухоподібна полімеризація Клітини не розпластуються, моношар не 12 утворюється Таким чином, наведені приклади підтверджують, що запропонований біосумісний гідрогель 85 медичного призначення може бути отриманий. У порівнянні із найближчим аналогом досягається 9 20134 значне зміцнення матеріалу, пролонгація вивільнення введених у його сполуку лікарських засобів, поліпшення біосумісності із клітинами, що вперше Комп’ютерна в ерстка А. Крулевський 10 показано на прикладі мезенхімальних стовбурових клітин людини. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601