Спосіб прогнозування вірогідності виникнення пухлинної патології ендометрія

Спосіб прогнозування вірогідності виникнення пухлинної патології ендометрія шляхом цитогенетичних досліджень лімфоцитів периферичної крові, який відрізняється тим, що лімфоцити периферичної крові культивують напівмікрометодом на середовищі 199, яке не містить фолатів, і при виявленні ламких сайтів хромосом 1q2.5-4.1; 2q2.43.1; 4q1.5; 5q1.4 прогнозують вірогідність виникнення пухлинної патології ендометрія. (19) (21) u200700562 (22) 22.01.2007 (24) 15.03.2007 (46) 15.03.2007, Бюл. № 3, 2007 р. (72) Запорожан Валерій Миколайович, Дубініна Владлена Геннадіївна, Пономаренко Андрій Іванович (73) ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ 3 21742 4 нках; встановлення частоти аберантних клітин; проводилася у термостаті при 37°С 15-20 хвилин. визначення частоти аберацій на одну досліджуПо закінченні інкубації проби центрифугували 5 вану й аберантн у клітини - на 100 досліджуваних хвилин при 1500 об/хв., відбирали надосадову клітин; характеристику аберацій хромосом. Врахорідину, ретельно струшували осад і вливали 6-7 вували як хроматидні, так і хромосомні аберації. мл фіксатора. Фіксація проводилася оцтовим алДля оцінки патогенетичного варіанту пухлинного коголем (3:1), фіксатор готувався ex tempore і попроцесу використовували критерій Бохмана [3]. До винен був бути попередньо охолодженим до передраку ендометрію відносили атипічну гіпер20°С. Фіксацію проводили 3-4 рази до отримання плазію. прозорої надосадової рідини. Довготривалість Отриманий цифровий матеріал піддавали стафіксації біла наступною: 1-а фіксація - 20 хвилин, тистичній обробці. 2-а фіксація - 90 хвилин. 3-4-а фіксація - 20 хвиАле у найближчому аналогу досліджують абелин, інкубація проводилася у морозильної камері ррації хромосом без урахування їх фрагільності при -20°С. Після кожного етапу фіксації проби (ламкості). центрифугували і потім обережно відбирали піпеВ основу корисної моделі поставлено задачу ткою надосадову рідину. Клітинний осад струшувдосконалення способу прогнозування виникнення вали. Після останньої фіксації проводили розкапупухлинної патології ендометрія шляхом цитогеневання суспензії клітин на предметні скельця. Для тичних досліджень лімфоцитів периферичної крові цього чисті предметні скельця занурювали у дисз використанням напівмікрометоду на середовищі тильовану воду та охолоджували у морозильній 199, яке не містить фолатів як додаткового маркекамері до створення на поверхні води тонкої кірора ризику розвитку онкозахворювання, що дозвочки льоду. Розкапування суспензії клітин проводилить підвищити вірогідність способу прогнозування лося пастерівською піпеткою на охолоджені мокрі виникнення пухлинної патології ендометрія. предметні скельця з висоти 15-20 см. Препарати Поставлена задача вирішується тим, що, згідно висушувалися на повітрі. з коринсою моделлю, лімфоцити периферичної Хромосомний аналіз проводили на системі крові культивують напівмікрометодом на середокаріотипування MetaSys-tems (Німеччина) із завищі 199, яке не містить фолатів, і при виявленні стосуванням програми „Ikaros". Було проаналізоваламких сайтів хромосом 1q2.5-4.1; 2q2.4-3.1; но не менш як 20 метафазних пластинок для кож4q1.5; 5q1.4 прогнозують виникнення пухлинної ної пацієнтки. патології ендометрія. У хворих пухлинною патологією ендометрія Спосіб виконують наступним чином. спостерігалась фрагільність у 22 сайтах хромосом Матеріалом для дослідження слугували лім(Фіг.1). Найбільша частота зустрічаємості фрагільфоцити периферичної крові 37 хворих з діагнозом них сайтів хромосом була у ділянках: 5q2.3-3.1 аденокарцинома ендометрія, 48 хворих з залозис(5,33%); 2q2.4-3.1 (9,33%; 1q2.5-4.1 (4,2%). Ламтою гіперплазією ендометрія, 11 хворих з атипічною кість хромосом у ділянках 2р1.5-2.2 (2%); Xq2.3гіперплазією ендометрія і 30 практично здорових 2.5 (1,8%); 1р3.3-3.4 (1,33%); 3q2.6 (2,2%); 4q1.5 жінок. Вік хворих був від 21 до 68 років. Хворі були (2,4%)4 10q2.5 (1,25%) була нерідкою знахідкою. обстежені до проведення терапії у гінекологічному Також була виявлена ламкість у ді лянках відділенні клініки Одеського державного медичного 1 q 1 .1 ; 1p1.2; 5pl.4 ; 5ql .6 ; 6q2 .6 ; 9q1 .1 ; 10q 1.1; університету. 12q1.1; 1 3q3 .2 ; 3q2 .2 ; 18q1 .1 ; 20 q1.1. У хворих Для культивування лімфоцитів периферичної на залозисту гіперплазію спостерігались поодинокі крові застосовували напівмікрометод. Забір крові випадки виявлення фрагільних сайтів, в гр упі проводився стерильно на гепарині. В умовах степрактично здорових жінок фрагільні сайти були рильного боксу проводилася посадка клітин для відсутні. У хворих на атипічну гіперплазію спостеріподальшого культивування. На кожного хворого гався такий спектр фрагі-льності: 1q2.5-4.1; 2q2.4ставилося 3-4 флакони. В кожний флакон додава3.1; 4q1.5; 5q1.4. Фрагільні сайти хромосом являли 5мл середовища 199, 75-125мкл фітогемагглюють собою специфічні локуси, які є особливо чуттиніну (ФГА), 0,5мл цільної гепаринізованої крові. ливими, формуючи пробіли, розриви та перебудоРідкі фрагільні сайти є фолат-чутливими і можуть ви хромосом. Цитогенетично фрагільний сайт бути виявлені на середовищі, яке збіднене фолавиявляється, як пробіл або неоднорідність у структами. Середовище 199 не містить фолатів та фолітурі хромосоми (Фіг.2), де фрагільна ділянка хроєвої кислоти, що є важливим для виявлення фрамосоми позначена стрілкою. Фрагільні сайти розгільних сайтів хромосом. Лімфоцити культивували діляють на дві групи: рідкі та загальні, у залежності 72 години у термостаті при 37°С. На 69 годині кульвід їх індукції та частоти зустрічаємості у популяції. тивування додавали колхіцин у концентрації Загальні фрагільні сайти виявляються у всіх інди0,15мкг/мл на 1,5 години (при 37°С), через деякий відуумів під впливом хімічніх мутагенів. Загальні час інкубації культуру лімфоцитів переносили у фрагільні сайти призводять до розривів і перебуцентрифужні пробірки та центрифугували 5 хвидов хромосом при розвитку раку. Рідкі фрагільні лин при 1500об/хв. на центрифузі з горизонтальсайти зустрічаються менш ніж у 5% індивідуумів та ним ротором. Обережно відбирали надосадову мають родинну сегрегацію. Більшість рідких фрарідину, клітинний осад ретельно струшували, догільних сайтів індукуєються дефіцитом фолатів. бивалися зникнення грудочок. Потім до взвісі кліДоведено, що дефіцит фолатів призводить до тин додавали гіпотонічний розчин (0,555% розчин розвитку як спорадичної, так і спадкової форм раку КСІ). Розчин хлористого калію повинен бути свіжопрямої кишки. Фолати є кофакторами для синтезу виготовленим і попередньо нагрітим у термостаті пуринів і пірімідинів, дефіцит фолатів призводить до 37°С. Інкубація клітин у гіпотонічному розчині до індукції гіпометілювання геномної ДНК. Таким 5 21742 6 чином, дефіцит фолатів індукує розриви ДНК, поспадкових факторів може мати велике значення у гіршує репарацію ДНК І призводить до різних мупрофілактиці і лікуванні на ранніх етапах розвитку тацій. Фрагільність експресується завдяки збільпухлинної патології ендометрія. Аналізуючи отришенню кількості ді- і тринуклеотидних повторів і їх мані дані, видно, що частина досліджених хворих метилюванню, в метафа-зних хромосомах форможе мати термінальні мутації у генах репарації муються складні структури із нуклеотидних повто(MSH6/GTBP, MSH2, R AD1, PMS1). На пізніх етарів, які зупиняють синтез ДНК. Рідкі фолатчутливі пах розвитку пухлини можуть проя вля тися сомафрагільні сайти асоційовані з неекспресованими ти чні м ута ці ї у гена х, які кон тро люють клі тингенами, деякі загальні фрагільні сайти можуть таний цикл (hCDC4), у гені рецептора 2 фактора кож торкатися експресованого гена через виникросту фібробластів, у генах інтер-лекінів, що бенення регіону хромосомної нестабільності. У табруть участь у патогенезі пухлини. лиці наведені усі фрагільні сайти, що зустрілися у Пухлинна патологія ендометрія входить до хворих, більшість фрагільних сайтів співпадає із складу спадкового синдрому Lynch або спадкового вже відомими сайтами фрагільності, практично усі неполіпозного раку товстої кишки (HNPCC). Є повиявлені фра гільні сай ти є загальними, тільки відомлення про наявність фрагільних ділянок хроодин сай т (18q1 .1) - рідкий . Три фра гільни х мосом у лімфоцитах крові хворих колоректальним сайти (1p1 .2, 12q1 .1 та 18 q1.1 ) не співпадають раком. ні з жодним з відомих фрагільних сайтів. НезважаВиявлено 22 сайти ламкості хромосом у хворих ючи на те, що фрагільні сайти у пацієнток з пухпухлинною патологією ендометрія і хвори х з атилинною патологією ендометрія виявилися на сепічною гіперплазією, більшість з них співпадає з редовищі, збідненому фолатами, в основному вже відомими сайтами. Три сайти є невідомими: проявилися загальні фрагільні сайти. Це може 1p1.1; 12q1.1.; 18q1.1. Переважена більшість вібути пов'язане з тим, що на пізніх стадіях розвитку домих виявлених сайтів є загальними, тільки один раку пухлиною продукуються речовини, які індукусайт відноситься до спектру рідких фолатчутлиють загальні фрагільні сайти. Відомо, що загальні вих. Сайти фрагільності у хворих пухлинною патофрагільні сайти індукуються інгібіторами нуклеологією ендометрія співпадають за хромосомною тидного обміну. локалізацією із відомими генами, що беруть участь Велика кількість ламких сайтів, що виявлено у патогенезі різних форм пухлинної патології ендонами, співпадають або локалізовані поблизу онкометрія, а також генів, що призводять до розвитку генів і протоонкогенів, що приймають участь у вицього захворювання. Виявлені фрагільні сайти никненні, прогресії пухлинної патології ендометрія хромрсом можуть бути цитогенетичними маркераабо є схильними до його появи. Мутацію у генах ми мутацій генів при пухлинної патології ендометрепарації PMS1, MSH6/GTBP, MSH2, COCA, рія. Фрагільні ділянки хромосом містять тандемноLCFS2, NF1 виявляються при спадкових формах повторювальні ді- і тринуклеотидні повтори. Пухпухлинної патології ендометрія (синдроми Tuirлинна патологія ендометрія у досліджених пацієнMorre, Lynch, нейрофіброматоз 1). Саме у регіонах ток була на пізніх етапах розвитку і ця обставина розташування цих генів і були виявлені фрагільні могла вплинути на спектр виявлення ламких сайсайти хромосом у хворих п ухлинною патологією тів- загальний (за причиною присутності у крові ендометрія (табл.1). У розвитку екстрагензалежної пацієнток речовин-інгібіторів н уклеотидного обміформи пухлинної патології ендометрія приймають ну, що продук ується пухлиною), а також сприяти участь гени PTEN, CYPIBI, C YP17, ER1, ER2 СОХсоматичним мутаціям, що виникають на пізніх ета1, СОХ2 та інші. Розташування фрагільних сайтів у пах розвитку пухлини (гени інтерлейкінів, hCDC4, хворих п ухлинною патологією ендометрія також PTEN та інші). співпадало із хромосомним розташуванням цих Таким чином, в порівнянні з найближчим анагенів. У патогенезі естрогензалежної пухлинної логом, запропоноване технічне рішення дозволяє патології ендометрія велику роль відіграють факспецифічні ламкі сайти хромосом рахувати за дотори ризику: ожиріння, синдром поліки-стозних помогою додаткового маркеру ризику розвитку оняєчників, діабет, гіпертонія. Як виявилося, хромокозахворювань, вдосконалює та підвищує вірогідсомна локалізація деяких з відомих генів, що відність способу прогнозування виникнення пухлинної повідають за ці захворювання, співпадають з лопатології ендометрія. калізацією фрагільних сайтів у досліджених нами Література: хворих пухлинною патологією ендометрія. Так, 1. Несина И.П., Полищук Л.З., Олийниченко відомі гени, що відповідають за спадкові форми П.И. Определение хромосомной сайт-ламкісті в ожиріння (HCHOLA3, CLF, FHCA), синдрома полілимфоцитах периферической крови больных колокистозних яєчників (HSD3B2, FSHR, GCCR , FST), ректальным раком с учетом отягощенности седіабе ту (SLC2 A1 (GLU T1), SOR BS I, GYS2, мейного анамнеза по онкопатологии // Цитология IRS2, FTN F4 A), гіпертонії (AGTR1, H YT4 , C YP8). и генетика, 2000. -Т.34, №1. -С.3-9. Хромосомна локалізація цих генів також співпа2. По ли щук Л.З., Не сина И.П . С тр ук турн ые дала з виявленими фрагільними сайтами. Таким аберрации хромо сом в лимфоцита х периферичином, встановлено, що спадкова обтяженість за ческой крови у больных предраком и раком энекстрагені тальними захворюваннями може відідометрия // Цитология и генетика, 1995. -Т.29, №3. гравати велику роль у розвитку естрогензалежної - С.17-25. пухлинної патології ендометрія. Отже, урахування 7 21742 8 Таблиця 1 № Фрагільний сайт Тип фрагільного сайту 1. 1q2.5-4.1 FR A1G(1q25.1),амфі диколіновий, загальний; FR A1K(1q31), ам фі диколіновий , загальний; 2. 1р3.3-3.4 FR A1B(1p32), амфідиколіновий , загальний; 3. 1 p 1 .2 4. 1 q 1 .1 FR A1J(lql2), 5 -азаци тидино вий , за гальний; 5. 2q2.4-3.1 FRA2 G(2q31), амфідиколіновий, загальний; 6. 2p 1.5-2.2 FR A2D(2pl6.2), амфідиколіновий, загальний; 7. 3q2.6-27 8. 4 ql .5 9. 4q2.8-3.1 Відомі гени-кандида ти, які приймають уча сть в р аз ви тк у п ухли нн и х п а то ло гій ендометрія СОХ2 (ген циклооксигенази-2) ІL10(ген інтер лейкіна-10) 10. 5q2.3-3.2 FRA3C(3q27), ам фідиколіновий, загальний; FR A4 A(4p16.1), амфі диколіновий, загальний; FRA4D(4q31.1), амфідиколіновий, загальний; FR A4E(4q27), некласи фікований, загальний FRA5C, амфідиколіновий, загальний; 11. 5 q1 .6 FRA5D, амфідиколіновий, загальний; 12. 5 p1 .4 FRA5E, ам фідиколіновий, загальний; FRA6E(6q26), амфідиколіновий, загальний; FRA9F(9q 12),5-азацитидиновий, загальний FR A10 G(10qll .2), ам фі диколіновий , загальний; 13. 6q2.6 14. 9 q 1 .1 15. 1 0q 1 .1 FR A10E(10q25.2), амфідиколіновий, 16. 10q2.5-2.6 загальний; FRA10F(10q26.1), амфідиколіновий, загальний; 17. 1 2q1 .1 FR A13B(13q21), BrdU-тип , загальний 18. 13q2.1-2.2 FR A13C(13q21.1), амфідиколіновий, загальний; FR A13D(13q32), амфі диколіновий, за19. 13q3.2 гальний; 20. 1 8q 1 .1 21. 2 0 p 1 .1 FRA20 A(20p1 1), фолатчутливий, рідкісний 22. Xq2.3 -2.4 FRAXC(Xq22 .1),aмфiдикoлiнoвий, загальний; SLC2A1(GLUT1)(nepeнощик глюкози 1) TNFRSF1B( ген рецеп тора фактора некрозу пухлин) НСН ОL AЗ(ген гіпер холестеролемії) HSD3B2(reH 3 b -гідроксистероїд дегі дрогенази) PMS1(reH міс-мач репараці ї) СОХ-1(ген циклооксигенази 1) GPD2( ген глицеролфосфа тдегідрогенази) MSH6 /GTBP(reH міс-мач репарації) СУР1В1(ген ци то хромоксидази 450) СОС А(ген , який ві дповідає за синдром Лінча) NF1 (нейрофіброматоз, типі) МSН2(синдром Tuir-Mo rre) FSHR(reH ре цептора фолік улстимулюючо го гормону) AGTRl(ген рецептора ан гіотензину) IL8(ген інтерлейкіна-8) hCDC4(reH циклін-залежної кинази-2) GCCR(ген глюкокортикоїдного рецептора) RAD1(білок контролю клітинного циклу(ДНКрепаруюча екзонуклеаза) FST (ген фо ліста тина, син дром полікистозних яєчників) ER1(ген естрогенового рецептора-1) FHCA(ген гипер холанемії) РТЕМ(гомолог фосфа тази і тензина) СYР17 (ген ци то хрома Р450) SORBSl (ген гомоло га сорбіна людини) FGFR 2 (ген ре це п тор а 2 фак то ра ро сту фібробластів) GYS2 (ген гликогенсинтетази) НУТ4(ген гіпертонії) CLF(ген холестеролзнижуючого фактора) IRS2(ген субстрата інсуліново го рецептора) LCFS2( синдром Lynch 2) HNF4A(ген нуклеарного фактора гепатоцитів, інсуліннезалежний діабет) СYР8(ген простагландин- 12-синте тази, гіпертонія) 9 Комп’ютерна в ерстка Н. Лисенко 21742 Підписне 10 Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601