Фармацевтична композиція, яка регулює гематопоез

Изобретение касается стабильных, неиммуногенных, физиологически хорошо совместимых, растворенных или сублимационно высушенных галеновых композиций из человеческих протеинов (белков), в особенности эритропоиэтина. Человеческие протеины представляют собой аутогенные, имеющиеся только в незначительных количествах протеины, как, например, тканевый плазмогенный активатор (t-PA), стрептокиназа, урокиназа, интерферон, стимулирующие различные колонии, факторы (CSF) или эритропоиэтин (ЕРО). На примере ЕРО, который предпочтительно используется в составе, изобретение поясняется подробнее. Эритропоиэтин (ЕРО) представляет собой гликопротеин, который стимулирует образование гемоглобина, соответственно, эритроцитов в костном мозгу. Этот гликопротеин образуется главным образом в почках, в очень незначительных количествах находится в сыворотке и при физиологических условиях частично выделяется в моче. Отсутствие ЕРО при почечной недостаточности обусловлено ренальной анемией. Благодаря введению ЕРО в физиологических количествах, т. е. несколько микрограмм, за одну или несколько дозировок можно снова возбуждать в таких случаях образование эритроцитов. Так как организм чувствительно реагирует уже на незначительные изменения дозы, то дозировка должна быть точно воспроизводима. Обычно ЕРО инъекцируют или вн утримышечно, или внутривенно в виде водного раствора или вводят в виде распыляемого раствора через слизистую оболочку носа. Однако, известно, что EPO, и именно как прежде всего полученный из человеческой мочи продукт (Mi yake и др., J. Biol. Chem. т. 25, 5558-5564, 1977). как также получаемые путем генной инженерии продукты (ВОИС 85-02610), в водном растворе нестабильны и даже при хранении при 80°С наступают большие потери активности. Эти оба вида продуктов отличаются несколько по образу гликозилирования и по активности, прямое сравнение с содержащимся в сыворотке ЕРО до сих пор не известно. Эти потери активности сводятся, с одной стороны, к разрушению ЕРО за счет каталитических эффектов поверхности служащих для хранения ампул благодаря следам тяжелых металлов, кислороду воздуха и т. д., с другой стороны, также за счет отложения ЕРО - молекул на стенках сосуда, причем также может происходить частично денатурация. Так как в каждой дозировочной единице должно содержаться только несколько микрограммов, потери за счет адсорбции уже спустя короткое время хранения могут быть значительными. В Европейском патенте А-178576 поэтому описано ингибирование этого отложения на стенках сосуда благодаря добавке полимерных соединений, как альбумин сыворотки человека или крупного рогатого скота, лецитин, декстран, целлюлоза, полиэтиленгликоль, и т. д., и, таким образом, достижение спустя примерно 2 ч хранения при 20°С обнаружения ЕРО е количестве 75-98%, в противоположность чему обнаруживают только 16% без такой добавки. При этом измерялось только обнаружение радиоактивной маркировки (14С), так что эти опыты ничего не говорят о стабилизации ЕРО от разложения. Установлено, что стабилизации в течение длительного времени с помощью таких средств нельзя достигнуть, т. е. ЕРО-активность в тесте на мыши сильно падает, к тому же эти средства при инфекции вызывают иммуногенные реакции. Из Европейского патента А-178665 известны "стабилизаторы", в особенности для сублимационно высушенных ЕРО-препаратов. Наряду с полимерными веществами ПЭГ 4000, желатиной и декстраном 40 названы различные сахара и многоатомные спирты, дающие при окислении моносахариды; аминокислоты; неорганические соли и тиольные соединения. Комбинации этих ве ществ с человеческим сывороточным альбумином, желатиной и декстраном также указаны. Также в этом литературном источнике определяется обнаружение радиоактивностей только спустя 2 мес хранения сублимационно высушенных продуктов. Оно указывается равным 87-99%, в противоположность 60% без добавок. Так как лиофилизированный материал используется непосредственно после получения в качестве стандарта, то не указаны потери активности при приготовлении препаратов. Также эти препараты обладают высокой потерей активности вместе на мышах. Задача изобретения - создание хорошо совместимого ЕРО-препарата, который стабилен при хранении, т. е. сохраняет ин виво активность, не приводит к адсорбциям на стенках ампул или шприцов и легко может переводиться в инъекцируемую форму. Задача решается благодаря подробнее охарактеризованной в формуле изобретения комбинации различных компонентов. Как показали опыты, индивидуальные вещества этими свойствами не обладают или обладают только в незначительней мере. Решающей для стабилизации является добавка мочевины и различных аминокислот. Мочевина используется в количестве 5-50 г/л, предпочтительно 10-15 г/л. В качестве аминокислот следует назвать, например, глицин, аланин, аргинин, L-лейцин, 2-фенилаланин, глутаминовая кислота или L-треонин. Смеси различных аминокислот имеют особенно предпочтительный эффект. Их используют в количествах 0,5-50 г/л, предпочтительно 1-20 г/л, причем общее количество должно составлять предпочтительно 5-25 г/л. Далее, необходим физиологически совместимый буфер, который в необходимых для инъекционных растворов незначительных концентрациях (примерно 20-100 ммоль/л) устанавливает необходимую для ЕРО pH область 6,5-7,4, в особенности 7,0-7,2. Кроме фосфатных буферов применимы также глицинат, карбонат, цитрат и другие, причем в качестве противоионов могут служить, кроме ионов натрия и калия, также ионы аммония. Буферирование дополнительно вызывается содержащимися аминокислотами. Прилипание ЕРО к стенкам ампул и шприцам существенно снижается за счет добавки незначительных количеств детергента. Так как препарат должен предпочтительно вводиться путем инъекции, это вещество должно быть физиологически, в особенности внутривенно, совместимо. Оказываются пригодными концентрации 0,05-5 г/л, в особенности 0,1-0,5 г/л. Неионные смачиватели, как различные виды полимакроголов, в особенности полиэтиленсорбитанлаурат (Твин 20 или 80) или сорбитантриолеат (Span 35 или 80) или полигликолевый эфир глицеринолеиловой кислоты (LabrafiP), оказываются пригодными для этой цели, однако в равной мере могут использоваться другие совместимые вещества. Для уменьшения влияния на ЕРО ионов тяжелых металлов, которые почти неизбежно увлекаются при обработке, например, из используемых металлических инструментов, оказывается пригодным добавление раствора 0,01-5 г/л растворимой кальциевой соли, предпочтительно примерно 0,02-0,2 г/л хлорида кальция. Также могут использоваться другие физиологически совместимые комплексообразователи, например, цитрат, EDTA, NTA, пантотенат. В качестве растворителя используют чистую воду для инъекционных целей, к которой для установления изотонии добавляются еще 0,5-10 г/л хлорида натрия или соответствующих веществ, как маннит, сорбит и т. д. Для получения предлагаемых препаратов все вспомогательные вещества растворяют в необходимом количестве воды, примешивают ЕРО-препарат, который должен иметь активность примерно 100000-200000 единиц/мг протеина, стерильно фильтруют в соотве тствующие ампулы, замораживают и осторожно лиофилизируют при низких температурах. Полученные препараты устойчивы в атмосфере азота в течение 2х лет при 0°С и в течение 1 года при комнатной температуре. При реконституировании с помощью воды они растворяются за несколько секунд без помутнения и, таким образом, могут прямо вводиться путем внутривенной или внутримышечной инъекции или после разбавления изотоническими растворами (например, раствором хлорида натрия) вливаться. Процессу замораживания придают особое значение. Вспомогательные вещества по роду и количеству выбираются так, чтобы эвтектическая точка замораживаемого раствора находилась между -50 и -30°С. С помощью управляемой компьютером программы оптимизации определялись следующие оптимальные условия для 3-х фаз лиофилизации: время замораживания: 12-14 ч при 40°С; основная сушка: температура рассола +20°С, давление 10-3 мбар, время 48-60 ч; дополнительная сушка: температура рассола +20°С, давление 10-3 мбар, время 4-6 ч. При этом существенным является распознавание с помощью измерительного устройства Ар, а также измерение электропроводности, когда закончится основная сушка, чтобы лиофилиэируемый продукт слишком быстро не нагревался и чтобы избегать оттаивания замороженного раствора и связанной с этим потери активности. Используемые вспомогательные вещества выбираются так, чтобы осуществлялось образование равномерно структурированного лиофилизируемого замерзшего тела и во время лиофилизации получался пористый скелет (осадок на фильтре), из которого возможна оптимальная сублимация льда, прежде всего также к концу основной сушки. Дополнительная сушка осуществляется, как указано выше, только при +20°С в течение 4-6 ч. Эта осторожная обработка является важной, так как иначе приходят к потере активности в случае слишком лиофилизованного материала. Как правило, таким образом лиофилизированные продукты имеют содержание воды по К. Фишеру примерно 2-5%, это остаточное содержание воды зависит от рода и количества вспомогательных веществ, которые используются в соотве тствующей рецептуре. Водные растворы стабилизированного ЕРО можно также непосредственно заливать в ампулы и без лиофилизации в виде готовой к употреблению формы использовать. Устойчивость, однако, благодаря этому по сравнению с лиофилизатом сокращается примерно до 1 года пру 0°С и нескольких месяцев при комнатной температуре. Пример 1. Сухое ве щество для инъекции с 2000 единиц эритропоиэтинг (состав для 35000 ампул); В стерильном, снабженном мешалкой емкостью 100 л V 2 A резервуаре с двойной рубашкой растворяют вспомогательные вещества, г: Мочевина - 700,0 Хлорид натрия 70,0 Твин 20 7,0 Дигидрофосфат натрия х 1Н2О 38,4 Динатрийгидоофосфат х 2Н2 О 350,0 Хлорид кальция х 2Н2О 8,4 Глицин 105,0 L-лейцин 140,0 L-изолейцин 140,0 L-треонин 35,0 L-глутаминовая кислота 35,0 1,-фенилаланин 70,0 Вода для инъекционных целей До 70,0 л К 30 л этого вспомогательного раствора добавляют 214,3 мл сырьевой загрузки эритропоиэтина с титром ЕРО 140000 ед./мл, доливают до конечного объема 35 л и перемешивают. С помощью остального раствора вспомогательных ве ществ споласкивают систему фильтрации. Раствор состава стерильно фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм. Стерильно профильтрованный раствор в асептических условиях заливают в склянки для инъекции емкостью 1 мл и сублимационно высушивают в установке для лиофилизации при следующи х критериях: время замораживания: 12-14 ч при -40°С, основная сушка: температура рассола -10°С, давление 10-1 мбар, время 48-60 ч, дополнительная сушка: температура рассола +20°С, давление 10-3 мбар, время 4-6 ч. Получают, таким образом, объемистое, с открытыми порами сухое вещество для инъекции, которое стабильно по крайней мере 2 года в холодильнике и 1 год при комнатной температуре и в течение нескольких часов растворяется в 2 мл воды для инъекционных целей без помутнения и частиц. Пример 2. Лиофилизат с 200 единицами эритропоиэтина (состав для 35000 ампул), г: Эритропоиэтин 46,7 мл = 7 Міо единиц Хлорид натрия 100,0 Твин 20 10,0 Дигидрофосфат натрия х 1Н2О 155,0 Динатрийгидро-фосфат х 2Н20 500,0 Хлорид кальция х 2Н2О 10,0 Мочевина 1000,0 L-лейцин 150,0 Треонин . 120,0 Фенилаланин 165,0 Вода для инъекционных целей До 70,0 л Вспомогательные вещества растворяют в 70 л воды для инъекционных целей и затем разделяют на 2 порции по 35 л. Первые 35 л смешивают с необходимым количеством ЕРО - биологически активного вещества . Вторые 35 л используют для ополаскивания системы фильтрации. Раствор состава стерильно фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм. Стерильно профильтрованный раствор при асептических условия х разливают в склянки для инъекции емкостью 1 мл и лиофилизируют при тех же критериях, как указано в примере 1. Получают, таким образом, белого цвета, пористый, хорошо растворимый в 2 мл воды лиофилизат, который может храниться без больших потерь активности 2 года в холодильнике или 1 год при комнатной температуре. Пример 3. Лиофилизат с 1000 единицами эритропоиэтина (состав для 35000 ампул), г: Эритропоиэтин 233,3 мл-35 Міо единиц Хлорид натрия 100,0 Твин 20 12,0 Дигидрофосфат натрия х Н2О 140,0 Динатрийгидрофосфат х 2Н2 О 450,0 Хлорид кальция х 2Н2О 10,0 Мочевина 700,0 Глицин 1050,0 L-лейцин 92,0 Глутаминовая кислота 103,0 Фенилаланин 115,5 Вода для инъекционных целей До 70,0 л Вспомогательные вещества растворяют в 70 л воды для инъекционных целей и затем разделяют на 2 порции по 35 л. Первые 35 л смешивают с необходимым количеством ЕРО - биологически активного вещества . Вторые 35 л используют для ополаскивания системы для фильтрации. Раствор состава стерильно фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм. Стерильно профильтрованный раствор при асептических условиях заливают в склянки для инъекции емкостью по 1 мл и лиофилизируют при тех же критериях, как описано в примере 1. Получают, таким образом, белого цвета, пористый, хорошо растворимый в 2 мл воды лиофилизат, который может храниться 2 года в холодильнике или 1 год при комнатной температуре, без больших потерь активности. Пример 4. Лиофилизат с 500 единицами эритропоиэтина (состав для 35000 ампул), г: Вспомогательные вещества растворяют в 70 л воды для инъекционных целей и затем разделяют на 2 порции по 35 л. Первые 35 л смешивают с необходимым количеством ЕРО - биологически активного вещества . Вторые 35 л используют для ополаскивания системы для фильтрации. Раствор состава стерильно фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм. Стерильно профильтрованный раствор разливают при асептических условиях в селянки для инъекции емкостью 1 мл и лиофилизируют при тех же критериях, как указано в примере 1. Получают, таким образом, белого цвета, пористый, хорошо растворимый в 2 мл воды лиофилизат, который может храниться без больших потерь активности 2 года в холодильнике или 1 год при комнатной температуре. Пример 5. Лиофилизат с 750 единицами эритропоиэтина (состав для 35000 ампул), г: Эритропоиэтин 175,0 мл = 26,25 Mio единиц Хлорид натрия 100,0 Твин 20 12,0 Дигидрофосфат натрия х Н2О 140,0 Динатрийгидро-фосфат х 2Н2 О 450,0 Хлорид кальция х 2Н2О 10,0 Мочевина 12,0 Глицин 1250,0 Изолейцин 98,0 Глутаминовая кислота 130,0 Фенилаланин 145,0 Вода для инъекционных целей До 70,0 л Вспомогательные вещества растворяют в 70 л воды для инъекционных целей и затем разделяют на 2 порции по 35 л. Первые 35 л смешивают с необходимым количеством ЕРО - биологически активного вещества . Вторые 35 л используют для споласкивания системы для фильтрации. Раствор состава стерильно фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм. Стерильно профильтрованный раствор разливают при асептических условиях в склянки для инъекций емкостью 1 мл и лиофилизируют при тех же критериях, как указано в примере 1. Получают, таким образом, белого цвета, пористый, хорошо растворимый в 2 мл воды лиофилизат, который может храниться без больших потерь активности 2 года в холодильнике или 1 год при комнатной температуре. Пример 6. Для того, чтобы испытать эффективность различных стабилизаторов, стандартную рецептуру с 1000 ед. ЕРО/мл, которая содержит ц качестве основного стабилизатора мочевину, смешивают со смесью поливинилпирролидона с белком, соответственно, различными аминокислотами и продукты лиофилизи-1 руют. Результаты представлены в табл. 1. Стабильность ЕРО после 6 нед хранения лйофилизата при 35°С, соответственно, 0°С, в тесте на селезенке мыши согласно методике G. Krystal в Exp. Hematol. І 11, 649-660 (1983), определяется следующим образом. Самкам B6C4F, - мышей весом примерно по 20 г (Центральный Институт для покупателей подопытных животных, Тон-новер) в два последовательных дня вводили путем инъекции интераперитонеально 60 мг/кг фенилгидразингидрохлорида. Спустя следующие 3 дня извлекали селезенку, клетки селезенки суспендировали в стерильной Kompfett-среде (модифицированная Eagle среда Dulbecco + 584,0 мг/л Lглутамина + 0,1 ммоль/л 2-меркаптоэтанола + 20% зародышевой телячьей сыворотки) и разбавляли до 4106 ядросодержащих клеток/мл. Суспензию, к которой прежде добавляют тест-вещество, соответственно, ЕРОстандарт, смотря по обстоятельствам в природных концентрациях, растворенные в BSA-буфере, распределяют на пластинках для микротитра (0,2 мл/углубление). После инкубации (22 ч, 37°С, воздух + 15% СО2) на углубление добавляют 20 мкл 3Н-метилтимидинового раствора с 1mСі и снова инкубируют 2 ч при 37°С. После этого содержимое переводят с помощью клеточного Harves и промывают дистиллированной водой. Встроение 3Н-тимидина определяют с помощью ß-сцинтилляционного счетчика и оценивают по отношению к стандартным препаратам. В качестве рабочего стандарта используют "Р009 - ЕРО - стандарт" Института генетики, Кембридж, Массачусетс, США, который содержит 112 ед. ЕРО/мл и 503 нг протеина (мл) (уравненный по отношению к ЕРО - стандарту WHO "International Reference Preparation of Erythropoieta, Human, Urinary for Broassay (2 no I.R.P., established 1971"). Стандартные концентрации находятся в области 10-1 GO mV/мл. Испытывающиеся на ЕРО-активность лиофилизаты сначала, на ампулу, растворяли в 2 мл воды для инъекционных целей, осуществляли дальнейшие разбавления -также, как в случае рабочего стандарта, -с помощью BSA буфера (8,75 г NaCI, 1,95 г СаС122Н2О,1,00 г BSA (бычий сывороточный альбумин фирмы Calbiochem), вода для инъекционных целей до 1 л) 3Н-Метил-тимидин (удельная активность : 2 Сі/ммоль) получали от New Engfand Nuclear. Пример 7. Таким же образом, как и в примере б, несколько измененную штамм-рецептуру смешивали с мочевиной и различными аминокислотами, соответственно, смесями. Для сравнения исследовали две содержащие маннит рецептуры, которые соответствуют Европейскому патенту 178665. Результаты представлены в табпице 2. Пример 8. Эритропоиэтин лиофилизат 500 Ед (смесь для 35000 флаконов). Композицию получают аналогично примеру 4. Вводят следующие компоненты при следующем соотношении, г: Получают хорошо растворимый в 2 мл воды лиофилизат, который может храниться 9 мес при комнатной температуре и 1,5 года в холодильнике без большой потери активности. Таблица