Спосіб підвищення толерантності кардіоміоцитів до доксорубіциніндукованого оксидативного стресу

1. Спосіб підвищення толерантності кардіоміоцитів до доксорубіциніндукованого 3 29411 Тому була запропонована ступенева схема терапії та профілактики доксорубіцин індукованої кардіоміопатії шляхом введення піддослідним щурам препаратів кверцетину [Мамчур В.Й., Шаламай А.С., Старченко М.Г., Кравченко К.О., Чернов Є.О. Використання нових лікарських форм кверцетину для профілактики доксорубіцинової кардіоміопатії в експерименті // Медичні перспективи. - 2005. - Т.10, №4. - С.4-8]. Однак нормалізація вмісту одного з продуктів перекисного окислення ліпідів - малонового діальдегіду й активності ферменту антиоксидантного захисту - супероксиддисмутази (СОД) у міокарді та лактатдегідрогенази у сироватці крові тварин у відповідності з вищезгаданою схемою, відбувається лише на 42-у добу, причому щоденного введення ін’єкційної форми (Корвітину) і таблеток кверцетину. Відомий спосіб зв’язування гідроксильних радикалів, що може відвертати розвиток оксидативного стресу чи послабляти його вираженість, шляхом застосування L-депренілу (селегіліну) [Wu R.M., Murph y D.L. Chiueh С.С. Supression of hydroxyl radical formation and protection of nigral neurons by L-deprenyl (selegiline) // Ann. N.Y. Acad. Sci.-1996.- V.786.- P.379-390]. Але сучасні уявлення про можливий біохімічний субстрат цитопротекторної дії селегіліну суперечні. Більш доказаною є нейропротекторна дія цього препарату, який інгібує активність моноаміноксидази типу В, що може бути результатом його безпосередньої дії на експресію антиапоптотичних генів. Існує спосіб підвищення толерантності кардіоміоцитів до оксидативного стресу шляхом активації опіатних рецепторів (ОР), зокрема, такими агоністами як DSLET і DTLET [Реброва Т.Ю., Маслов Л.Н., Лишманов Б.Ю., Там СВ. Стимуляция m- и d-опиатных рецепторов и устойчивость изолированного сердца к окислительному стрессу: роль NО-синтазы // Биохимия. - 2001. - Т.66, №4. - С.520-528; Реброва Т.Ю., Маслов Л.Н., Ли шманов Б.Ю., Там СВ. Роль m- и d-опиатных рецепторов в формировании резистентности миокарда к свободнорадикальному повреждению // Рос. физиол. журн. - 2001. - Т.87, №5. - С.628-641]. Цей спосіб найбільш ефективний з існуючих і тому обраний в якості прототипу. До недоліків прототипу відноситься те, що вищезгадані опіоїди проходять через гематоенцефалічний бар’єр, тому питання про те, з активацією яких (центральних або периферичних) δ-рецепторів пов’язаний їх кардіопротекторний ефект залишається відкритим. Задачею корисної моделі було удосконалення відомого способу підвищення толерантності кардіоміоцитів до доксорубіцин індукованого оксидативного стресу (ДІОС), а саме зменшення ймовірності виникнення ЗСН, а у випадку розвитку останньої - суттєве зменшення її проявів. Указана задача досягається активацією ОР опіоїдної системи експериментальних тварин, зокрема, шляхом введення їм даларгіну (D-Ala2Lеu5-Аrg6-енкефаліну) у вигляді 4 внутрішньочеревинної ін’єкції у дозі 100мкг/кг спочатку за 20 хвилин до одноразового інтраперітонеального введення доксорубіцину, а потім в один і той же час у тій же дозі ще протягом тижня поспіль. Ця пропозиція базується на вперше встановленій автором корисної моделі закономірності, яка полягає в тому, що при ДІОС вірогідно збільшується вміст суми стабільних метаболітів оксиду азоту - NO2-, NO3- і окремо NO3, вільного сфінгозину (ВС), фрагментованої дезоксірибонуклеїнової кислоти (ф-ДНК) та СОД в гомогенаті серцевого м’яза дослідних щурів, загальна оксидантна активність (ЗОА) сироватки крові, рівень нітритів і нітратів у тій же тканині, а також знижується спін-спіновий (Т2) час релаксації протонів води в міокарді, абсолютна кількість і відсоток NO2в останньому, загальна антиоксидантна активність (ЗАОА) сироватки крові та відсоток нітритів у тій же тканині, що може свідчити про пригнічення ендогенної антиоксидантної системи та активацію перекисних процесів у клітинах серця, які сприяють переходу більшої частки оксиду азоту в пероксинітрит, що виявляє цитотоксичну та проапоптотичну дію на клітину, у той час як за експериментальними даними автора введення даларгіну супроводжується суттєвими зсувами досліджуваних показників у бік контрольних величин, а то й їх нормалізацією. До того ж відомо, що даларгін може знижувати вираженість пошкодження серцевого м’яза при ішемії та стресових діях, ступінь активації перекисного окислення ліпідів у міокарді щурів (а цей інгібуючий вплив реалізується завдяки активації периферичних стреслімітуючи х систем: антиоксидантів і простагландинів), виявляти антиоксидантну, антигіпоксичну та гіпотензивну дії, кардіопротекторний і антиаритмічний ефектпри ішемії та реперфузії. Автори, зокрема останніх ефектів, вважають, що вони опосередковані саме активацією периферичних m-ОР. Тим не менше, питання про механізми кардіопротекторної й антирадикальної дії енкефалінів до кінця не зрозумілі. Залишається відкритим і питання про здатність енкефалінів чинити пряму антиоксидантну дію на органному рівні, а також виявляти свої ефекти у відношенні метаболізму арахідонової кислоти. Нарешті встановлено, що при активації ОР мононуклеарних клітин крові даларгіном він стимулює апоптотичну загибель останніх, тоді як за умов гормонально індукованого апоптозу - інгібує його, що не виключає особливостей перебігу цього процесу та таких, що йому передують (оксидативний стрес), зокрема в кардіоміоцитах. Отже, наша пропозиція щодо введення даларгіну тваринам з ДІОС базується на ретельному вивченні особливостей патогенезу цього процесу, тим більше, що питання про механізми кардіопротекторної та антирадикальної дії енкефалінів до кінця не вияснено. Даний препарат з метою удосконалення способу підвищення толерантності кардіоміоцитів до ДІОС застосований вперше. Спосіб здійснюється таким чином. Білим щурам-самцям 16-18-тижневого віку за 20 хвилин 5 29411 до інтраперітонеальної ін’єкції сублетальної дози (20мг/кг) доксорубіцину гідрохлориду (ОАО "Київмедпрепарат") та в один і той же час протягом ще тижня поспіль вводять агоніст m- и dОР даларгін у вигляді вн утрішньочеревинної ін’єкції кожен раз у дозі 100мкг/кг. Лабораторними критеріями ефективності призначення даларгіну є зменшення в бік нормалізації вмісту ВС, ф-ДНК, суми нітритів і нітратів, окремо NO3- у серцевому м’язі, ЗОА сироватки крові, рівня NO2- і NO3- у тій же тканині, а також збільшення Т2-часу релаксації протонів води в міокарді, активності СОД, абсолютної кількості та відсотку нітритів в останньому, ЗАОА сироватки крові та відсотку NO2- у тій же тканині, що свідчить про активацію антиоксидантної та стреслімітуючих систем, інгібіювання сфінгомієлінового циклу, зменшення внутрішньоклітинного об’єму перекисних процесів і процесів апоптозу, що в ітозі приводить до зниження концентрації вільних радикалів і підвищення толерантності кардіоміоцитів до ДІОС. Саме введення даларгіну сприяє патогенетично позитивним зсувам лабораторних показників, а в клінічному аспекті проблеми - покращенню загального стану тварин, менш інтенсивному падінню маси їх тіла та зменшенню смертності. Вищевказані доза та курс введення даларгіну були підібрані нами досвідним шляхом. Саме при такому введенні даларгіну, яке вказане в заявці на корисну модель, забезпечується максимальне зменшення в бік контрольних значень вмісту ВС, ф-ДНК, суми нітритів і нітратів, окремо NO3- у серцевому м’язі, ЗОА сироватки крові, рівня NO2- і NO3- у тій же тканині, а також збільшення Т2-часу релаксації протонів води в міокарді, активності СОД, абсолютної кількості та відсотку нітритів в останньому, ЗАОА сироватки крові та відсотку NO2- у тій же тканині. Отже, новим є як сам препарат, який нами вперше використовується в профілактиці ДІОС кардіоміоцитів, так і схема його застосування, що дуже важливо, оскільки, як відомо, надмірна активація кардіальних адренорецепторів в умовах гострої ішемії міокарда може провокувати появу шлуночкових аритмій та сприяти збільшенню споживання кисню міокардом, забезпечуючи, тим самим, розширення зони некрозу. При розробці заявленого способу було обстежено дві групи щурів з ДІОС. Перша (І) група тварин за 20 хвилин до ін’єкції доксорубіцину та в один і той же час ще протягом тижня поспіль отримувала даларгін внутрішньочеревинно кожен раз у дозі 100мкг/кг. Аналізували динаміку клінічних показників в обстежених щурів, а в якості лабораторних критеріїв ефективності профілактики гострого ДІОС - динаміку Т1- і Т2часу релаксації протонів води, активності СОД, вмісту ВС, ф-ДНК, нітритів і нітратів, відсотку NO 2в гомогенаті серцевого м’яза тварин і деяких тих же показників, а також ЗОА та ЗАОА їх сироватки крові. Друга (II) група щурів замість даларгіну отримувала у ті ж строки відповідний об’єм ізоосмотичного (фізіологічного) розчину. Як клінічні, так і лабораторні показники порівнювали в обох групах тварин з ДІОС, а також з контрольною 6 групою інтактних щурів того ж віку, яких утримували в аналогічних умовах і декапітували та у яких брали кров для дослідження на 1, 3, 5 і 7-у добу експерименту. До введення доксорубіцину в обох групах тварин, які були під наглядом, - основній (першій, І), що отримувала профілактику ДІОС відповідно з заявленим способом, і зіставлення (другій, II), в якій вводили ізоосмотичний розчин, була однотипова клінічна симптоматика. При цьому, не було встановлено вірогідної різниці між величинами концентрації нітритів, нітратів і відсотку NO2- у сироватці крові, Т1- і Т2-часу релаксації протонів води, ЗОА та ЗАОА тієї ж тканини щурів обох гр уп до введення їм доксорубіцину, що свідчить про однотиповість обстежених груп. При клінічному та біохімічному моніторингу з моменту введення доксорубіцину щурам обох груп було встановлено, що в І гр упі (в якій вводили даларгін) уже з першої доби експерименту у більшості випадків відмічався непоганий загальний стан тварин, серед яких був лише один смертельний наслідок (2%), а маса їх тіла та серця зменшувалася протягом трьох діб і несуттєво (максимально на 6% і 10% відповідно). У той же час, у щурів II групи (в якій вводили ізоосмотичний розчин) загальний стан тварин був помітно гіршим, маса їх тіла та серця була зниженою протягом уже п’яти діб (максимально на 11% і 17% відповідно) і троє померло (5%), що свідчило про появу та прогресування у них проявів ДІОС. Динаміка лабораторних тестів, які були досліджені в обстежених тварин, наведені в таблицях 1 і 2. Т1- і Т 2-час релаксації протонів води, ак СОД, вміст ВС, ф-ДНК, нітритів і нітратів, відсоток NO2- у мі Показники Період проведення обсте 3-я доба Норма 1-а доба ВС, мкг/100мг 2,08±0,31 2,87±0,26 3,05±0,19* 4,13±0,47** 7,02±1,13** ф-ДНК, % 4,75±0,31 7,24±1,14* 8,68±1,20** 7,45±0,64** 9,33±0,94*** СОД, % 17,51±1,2 8 83,46±4,91*** 81,71±8,69*** 36,38±2,49* 48,25±3,27*** Т1, м/сек 666,29±1 6,39 690,93±20,12 664,89±13,80 676,47±9,10 662,17±19,70 Т2, м/сек 54,10±1,8 8 48,57±0,98* 52,54±0,68 48,65±1,15* 49,15±2,40 NO, мкг/г 74,61±4,7 5 91,79±3,98* 97,59±7,89* 97,61±6,40* 111,19±6,77*** NO2, % 4,73±0,53 4,94±0,26 3,62±0,27 3,36±0,12* 2,79±0,08** 7 29411 8 Відсоток ф-ДНК збільшувався лише на 2,45%, 2,70%, величинами показників щурів ІІ групах той Примітки для табл. 1, 2: Р відображає вірогідність різниці між 2,15% і 0,29% у міокарді у І та І гр упи, у на час як у щурів II упи всіх етапах обстеження; у чисельнику - значення показників у тварин І гр упи, -уна 3,93%, 4,58%, гр упи; і знаменнику - II 3,82% 0,67% на 1, 3, 5 і 7-у - при Р