Спосіб оцінки ризику повторних епізодів бронхіальної обструкції у дітей, які перенесли гостру респіраторну вірусну інфекцію з бронхообструктивним синдромом

Спосіб оцінки ризику повторних епізодів бронхіальної обструкції у дітей, які перенесли гостру респіраторну вірусн у інфекцію з бронхообструктивним синдромом, шляхом дослідження проби крові, який відрізняється тим, що лімфоцити периферичної крові інкубують з сенсибілізованими еритроцитами барана, потім визначають антитілозалежну клітинну цитотоксичність лімфоцитів, і у випадку, якщо вона ви ходить за межі інтервалу 3671%, констатують ризик рецидиву бронхообструктивного синдрому. (19) (21) 97062602 (22) 03.06.1997 (24) 15.11.2000 (33) UA (46) 15.11.2000, Бюл. № 6, 2000 р. (72) Безруков Леонід Олексійович, Колоскова Олена Костянтинівна, Швигар Леонід Володимирович (73) HАУКОВО-ДОСЛІДНИЙ ІНСТИТУТ МЕДИКОЕКОЛОГІЧНИХ ПРОБЛЕМ МІНІСТЕРСТВА ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ 29765 вність антитілозалежної цитотоксичності лімфоцитів, враховуючи яку, оцінюють ризик розвитку синдрому бронхіальної обструкції. Запропоноване технічне вирішення відрізняється від прототипу тим, що як показник ризику розвитку рецидивів бронхообструктивного синдрому у дітей, які перенесли ГРВІ з ознаками обструкції бронхів, використовують показник антитілозалежної цитотоксичності лімфоцитів їх периферичної крові. Ця відмінність дозволяє зробити висновок про відповідність технічного вирішення, що пропонується, критерію "новизна". Суттєва ознака, що відрізняє запропоноване технічне вирішення від прототипу, не виявлена в інших те хнічних вирішеннях при визначенні даної і суміжної галузей науки і, таким чином, забезпечує відповідність запропонованого вирішення критерію "суттєва відмінність". Спосіб здійснюють таким чином. Лімфоцити периферичної крові дитини, яка перенесла ГРВІ з бронхообструктивним синдромом, отримані в період клінічного благополуччя на градієнті феколверографіну (Boyum A. Isolaion of mononuclear cells and granulocytes from human blood. // Scand. J. Clin. Lab. Ivest. – 1968. – Vol. 21, suppl. 97 - P. 77-82) доводили до концентрації 2´1000000 розведенням середовищем № 199. Антисироватку до клітин-мішеней (еритроцитів барана) отримували шляхом триразової імунізації кроликів 10 мл 10% суспензії еритроцитів барана (ЕБ). Суспензію готовили таким чином: ЕБ двічі відмивали центрифугуванням у фізіологічному розчині (0,94% NaCl) і 1 мл осадку розводили в 9 мл стерильного фізіологічного розчину. Імунізацію проводили тричі з інтервалом у 1 тиждень. Через тиждень після останньої імунізації у кролика забирали кров у суху пробірку, відокремлювали сироватку та інактивували її 30 хвилин при 56 градуса х за Цельсієм. Титр сироватки визначали реакцією гемаглютинації. Для постановки реакції АЗКЦ використовували сироватку в субаглютинуючому розведенні. В даній роботі титр дорівнював 1:16000. Мішені для реакції готували шляхом відмивання ЕБ центрифугуванням в забуферному фізрозчині при 400 G протягом 10 хвилин. Із отриманих відмитих еритроцитів готували 0,5% суспензію, для чого 500 мкл осаду еритроцитів розводили в 10 мл середовища № 199. Приготовлену 0,5% суспензію еритроцитів барана змішували з рівним об'ємом сироватки кролика в субаглютинуючому розведенні. Суміш інкубували 30 хвилин при 37 градусах за Цельсієм для утворення комплексів антигенеритроцит барана (АГ-ЕБ). Утворені комплекси двічі відмивали центрифугуванням в середовищі № 199 по 10 хвилин при 400 G. Підраховували кількість клітин в камері Горяєва і доводили, розводячи середовищем № 199 із антибіотиками, до концентрації 4´ ´100000 мл. Рівень АЗКЦ визначали спектрофотометричним методом. В силіконізовані пробірки вводили мірною піпеткою по 100 мкл суспензії ефекторних клітин і сенсибілізованих чи інтактних еритроцитів барана у вищенаведених концентраціях, які забезпечували співвідношення 5:1 (ефектор:мішень). Всі пробірки розташовували в трьох паралелях. Суміші клітин інкубували при температурі 37°С у вологій атмосфері із вмістом 5% СО2 протягом 16 годин. По закінченні інкубації пробірки охолоджували 15-20 хвилин при температурі 4°С, центприфугували 10 хвилин при 400 G, після чого 100 мкл суспернанту переносили для обчислення з одних пробірок в інші, для визначення концентрації гемоглобіну, що виділився із зруйнованих клітинами-ефекторами еритроцитів барана, при цьому використовували солянокислий бензидин. Солянокислий бензидин ("Reanal") розчиняли в 0,2-молярному ацетатному буфері (рН 4,6) при температурі 70-80°С для отримання 0,1% розчину бензидину. В пробірці з супернатантом дослідних і контрольних проб додавали по 100 мкл солянокислого бензидину і 3% свіжоприготовленого розчину перекису водню на дистильованій воді. Інтенсивність отриманого розчину блакитного забарвлення вимірювали на спектрофотометрі СФ-266 при довжині хвилі 620 нм. Величина оптичної щільності зростала протягом кількох секунд, потім наставав період стабілізації, після чого щільність зменшувалась. Показники реєстрували на максимумі реакції. Цитотоксичну активність кілерних клітин визначали за формулою: АЗКЦЛ = (А1 + А 2 + А3) - (В1 + В2 + В3) х100%, (С1+ С2 + С3 ) де: А1+А2+А3 - сумарна величина показників проб, що вміщувала е фекторні клітини і сенсибілізовані еритроцити барана; В1+В2+В3 - показники проб, що вміщували ефекторні клітини і інтактні еритроцити; С1+С2+С3 - сумарна величина при максимальному лізисі даної кількості еритроцитів дистильованою водою. В тих випадках, коли показники активності АЗКЦЛ виходять за межі інтервалу 36-71%, констатують високий ризик рецидивування бронхообструктивного синдрому у дітей, які перенесли ГРВІ з клінічними ознаками обструкції бронхів. Вказаний діагностичний інтервал отриманий при обчислені значущості якісних відмінностей за допомогою точного методу Фішера (ТМФ) дво х виборок (Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. - Л.: Медицина, 1978. - С. 82-84) значень активності АЗКЦЛ у дітей, які перенесли ГРВІ з бронхообструктивним синдромом з наступним частим рецидуванням цього синдрому (2 та більше випадків в рік) та рідкими повторними епізодами бронхіальної обструкції (не більше 1 в рік) за даними катамнеза (табл. 1). Достовірність запропонованого способу виявлення повторних епізодів синдрому бронхіальної обструкції у дітей, які перенесли ГРВІ з клінічними ознаками обструкції бронхів, підтверджується статистичною значущістю відмінностей двох альтернативних розподілів показників АЗКЦЛ з ура хуванням представленого в табл. 1 "діагностичного порогу", що визначається методом ТМФ (табл. 2). Таким чином, при значеннях активності АЗКЦЛ, які виходять за межу діагностичного інтервалу 36-71%, ризик рецидування бронхообструк 2 29765 тивного синдрому визначається з достовірністю Ртмф0,05). Відсутність суттєви х відмінностей при виявленні ризику рецидування бронхообструктивного синдрому методом прототипу пов'язане з частими хибно-позитивними та хибно-негативними результатами. Оскільки в оцінці переваг двох способів діагностики більше значення має не суттєвість їх відмінностей, а сила їх інформативності, при порівнянні способу, що пропонується та способупрототипу був використаний метод дивергенції розподілів (Д) з наступним кутовим перетворенням Фішера (Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. - Л.: Медицина, 1978. - С. 91-104). В табл. 3 представлено порівняння способупрототипу методом дивергенції розподілів (Д) і кутового перетворення Фішера (о). Таким чином, величина діагностичної інформативності виявлення ризику повторних епізодів бронхіальної обструкції у дітей, які перенеси ГРВІ з бронхообструктивним синдромом, в період клінічного благополуччя способом, що пропонується, суттєво вища, ніж способом-прототипом. Клінічні приклади Саша К., 1 рік 4 міс., № історії хвороби 2043. Діагноз: ГРВІ, аденовірусна інфекція, гострий обструктивний бронхіт. При обстеженні в катамнезі активність АЗКЦЛ – 27%, Ig Е – 65 кЕ/л, за останній рік спостереження відмічалися 8 разів ГРВІ з бронхообструктивним синдромом. Тетяна Т., 1 рік 4 міс., № історії хвороби 2106. Діагноз: ГРВІ, гострий обструктивний бронхіт. Активність АЗКЦЛ – 56%, Ig Е – 210 кЕ/л, за рік спостереження відмічений 1 раз ГРВІ з бронхообструктивним синдромом. Галя Д., 8 місяців, № історії хвороби 3793. Діагноз: ГРВІ, аденовірусної етіології, обструктивний бронхіт. При катамнестичному обстеженні АЗКЦЛ становило 47%, Ig Е – 120 кЕ/л, рецидивів ГРВІ з бронхообструктивним синдромом відмічалося 1 раз за період спостереження. Микола Л., 4 роки, № історії хвороби 3951. Діагноз: ГРВІ, обструктивний бронхіт. АЗКЦЛ – 48%, Ig Е – 118 кЕ/л, протягом останнього року спостереження відмічалося 4 випадки ГРВІ, та лише один супроводжувався бронхообструктивним синдромом. Таким чином, використання способу, що пропонується, дозволило надійно оцінити ризик рецидування синдрому бронхіальної обструкції у дітей, в анамнезі яких відмічалися ГРВІ з бронхообструктивним синдромом. Використання запропонованого винаходу дозволяє досягти достовірної оцінки ризику повторних епізодів бронхіальної обструкції у дітей при наявності в їх анамнезі вказівок на перенесені ГРВІ з синдромом бронхіальної обструкції. Це дає можливість раціонально формувати групи диспансерного спостереження з наступним зменшенням частоти рецидивів бронхообструктивного синдрому, та, таким чином, скороченням необгрунтованого проведення дезобструктивної терапії. Крім того, це дозволить зменшити проведення необгрунтованих протирецидивних заходів. Цим забезпечується позитивний вплив на стан здоров'я дітей, а також отримання позитивного економічного ефекту. Таблиця 1 Впорядковані ряди значень АЗКЦЛ (в %) у дітей з частими і рідкими повторними епізодами бронхіальної обструкції АЗКЦЛ (в %) у ді тей з частотою рецидивів БОС (на рік) 2 і більше, n=37 Не більше 1, n=37 12 15 (18)x3 20 21 22 24 25 (26)x2 29 30 (32)x2 34 (35)x2 (36)x2 (36)x2 (38)x2 38 3 29765 Продовження табл. 1 АЗКЦЛ (в %) у ді тей з частотою рецидивів БОС (на рік) 2 і більше, n=37 Не більше 1, n=37 39 40 (40)x4 Межа впорядко(41)x2 ваних рядів ("діа42 гностичний поріг") (42)x4 для визначення 43 значущості якіс44 них відмінностей 45 за допомогою (46)x2 ТМФ (47)x3 47 48 48 49 52 (54)х2 (55)х2 (58)х2 59 60 61 (62)х2 (62)х2 64 65 70 71 (72)х2 74 81 Таблиця 2 Значущість показників активності АЗКЦЛ способом, що пропонується Клінічні групи дітей (частота БОС* протягом року 2 епізоди і більше Не більше 1 епізоду Всього (L1+L2)-L3 = -7,977 Кількість дітей 37 37 74 Ртмф