Спосіб гістохімічного виявлення сечової кислоти та її солей в тканинах та органах

1. Спосіб гістохімічного виявлення сечової кислоти та її солей в тканинах та органах, який передбачає відбір досліджуваного матеріалу під час біопсії, оперативного втручання або автопсії, фіксацію його в абсолютному етанолі протягом 24 год. при двократній його зміні, зневоднення з використанням ацетону та бензолу, заливку в парафін та виготовлення гістозрізів за допомогою санного мікротома, наклеювання зрізів на предметні стекла, депарафінування за допомогою ксилолу і перенесення препаратів у низхідний ряд спиртів, фарбування препаратів з використанням у фарбуючому розчині нітрату срібла, споліскування у дистильованій воді, дофарбовування препаратів з використанням спиртового розчину еозину, проведення препаратів через висхідний ряд спиртів та просвітлення у двох змінах ксилолу, покривання покривними скельцями з використанням прозорих смол, аналіз результатів мікроскопічного дослідження одержаних препаратів, який відрізняється тим, що після фіксації у абсолютному етанолі досліджуваний матеріал переносять у три зміни безводного ацетону, по 1,5 год. у кожному, а далі вносять його у суміш ацетон-бензолу (1:1) на 30 U 2 (11) 1 3 36706 плазунів і остаточного (гістохімічного) підтвердження діагнозу; 4) у медицині - при постановці і підтвердженні діагнозу сечокислого інфаркту нирок та подагри; 5) у біохімії - при дослідженні таких продуктів обміну речовин, як сечова кислота та її солі. Утворення сечовини та її солей є важливим процесом нейтралізації аміаку. На долю сечовини припадає 90% азоту, що виділяється з організму ссавців. Сечовина здебільшого синтезується у печінці за допомогою орнітинового циклу Кребса. Щодоби з організму людини з сечею виділяється 20-30г сечовини, що запобігає виникненню алкалозу. На сьогоднішній день відомі різні способи гістохімічного виявлення сечової кислоти та її солей. В нормальних умовах життєдіяльності сечова кислота зустрічається в тканинах у формі кристалічно-кислого урату натрію (Пирс Э. Гистохимия. М., изд-во иностранной литературы, 1962. - 962с.). Проте унаслідок порушення обміну речовин і виникнення сечокислого діатезу кількість сечової кислоти та її солей (уратів) різко зростає. При цьому ці сполуки відкладаються в органах і тканинах, спричиняють подразнюючу дію та розвиток регресивних змін. Урати володіють двома гістохімічними особливостями: аргентофілією та базофілією. Тому виявлення їх базується на цих властивостях. Відомий спосіб Маллорі (Лили Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. - М.: Мир, 1969. - 645с.) призначений для виявлення сечової кислоти та уратів. Спосіб включає: 1) фіксацію матеріалу у 100% етанолі; 2) проводення матеріалу через три зміни ацетону - по 1,5год. у кожній; 3) занурення зафіксованого матеріалу в суміш ацетону і бензолу (1:1) - 30хв; 4) обробку у двох змінах бензолу - по 30хв. у кожній; 5) заливку у парафін і виготовлення зрізів за допомогою санного мікротома; 6) депарафінізацію і доведення зрізів до 100% спирту; 7) фарбування в карміні (весь час погойдуючи препарати) - 5хв.; Розчин карміну готують за такою схемою: доводять до кипіння 1г карміну, 2г NH4Cl, 0,5 г карбоната літію в 50мл дистильованої води; охолоджують і додають 20мл 28% аміачної води. Для фарбування змішують 6мл основного розчину з 3мл 28%-ної аміачної води і 5мл метилового спирту. 8) промивають в декількох змінах 100% етанолу; 9) просвітлюють в ксилолі і заключають в бальзам; Результат: ядра - сіро-голубі; цитоплазма жовта; кристали сечової кислоти - темно синьозеленого кольору, урат натрію - яскраво-зелений. Найбільш близьким по суті до способу, що заявляється є спосіб Гоморі (Кононский А.И. Гистохимия. - К.: Вища школа, 1976. - 278с/). При цьому способі в складі реактивів міститься гексамін (уротропін), який взаємодіє з сечовою кислотою та 4 нітратом срібла/Унаслідок цього срібло відновлюється. Схема постановки реакції є такою: 1) матеріал фіксують у 100% етанолі - 24год. (етанол двічі змінюють); 2) заливають в парафін; 3) за допомогою санного мікротома готують зрізи товщиною (5-7мкм), наклеюють на предметні скла за допомогою 95% етанолу; 4) висушують в термостаті при 37° протягом 2ох годин; 5) депарафінують петролейним ефіром і промивають абсолютним етанолом; 6) занурюють в фарбуючий розчин на 15-60хв. до почорніння. Фарбуючий розчин готують за такою схемою: до 100мл 3% розчину гексаміну додають 5мл 5% розчину нітрату срібла, після розчинення осаду до суміші додають 5мл боратного буферного розчину (рН=8). Буферний розчин готують таким чином: до необхідної кількості 3% борної кислоти додають одну краплю фенолфталеїну і титрують 1н. розчином NaOH до появи рожевого забарвлення, а потім додають дистильованої води до 200мл. 7) споліскують в розчині тіосульфату Na 3хв.; 8) дофарбовують еозином; 9) промивають у воді; 10) обезводнюють в спиртах, просвітлюють в ксилолі, заключають в полістерол. Результат: локалізація сечової кислоти та її солей визначають за розміщенням чорного осаду. Заявлений спосіб і прототип мають загальні спільні ознаки: відбір досліджуваного матеріалу під час біопсії, оперативного втручання або автопсії, фіксацію його в абсолютному етанолі протягом 24год при двократній його зміні, зневоднення з використанням ацетону та бензолу, заливку в парафін та виготовлення гістозрізів за допомогою санного мікротома, наклеювання зрізів на предметні скла, депарафінування за допомогою ксилолу і перенесення препаратів у низхідний ряд спиртів, фарбування препаратів з використанням у фарбуючому розчині нітрату срібла, споліскування у дистильованій воді, дофарбовування препаратів з використанням спиртового розчину еозину, проведення препаратів через висхідний ряд спиртів та просвітлення у двох змінах ксилолу, покривання покривними скельцями з використанням прозорих смол, аналіз результатів мікроскопічного дослідження одержаних препаратів. Основними недоліками зазначеного способу є те, що він є досить трудомісткими, вимагає значних затрат часу, а також є дорогими у зв'язку з використанням різноманітних складних реактивів і хімічних сполук, які мають високу ціну. Запропонований нами спосіб усуває недоліки прототипу і забезпечує швидке, якісне та недороге контрастне виявлення сечової кислоти та її солей в тканинах та органах на гістопрепаратах. В основу корисної моделі покладено завдання - розробити зручний та економічно вигідний спосіб гістохімічного виявлення сечової кислоти та її солей в тканинах і органах, який можна застосовувати який можна застосовувати у практичному використанні, ефективний спосіб виявлення сечової кислоти та її солей в тканинах та органах тварин. 5 36706 Технічний результат досягається тим, що після фіксації у абсолютному етанолі досліджуваний матеріал переносять у три зміни ацетону, протягом 1,5год у кожному, а далі вносять його у суміш ацетон-бензолу (1:1) на 30хв і послідовно обробляють у дво х змінах бензолу по 30хв у кожній, витримують у бензол-парафіні (1:1) при 38°С протягом 30-120хв, переносять у дві порції парафіну на 30-60хв в кожному за температури 53-54°С, заливають у парафін за загальноприйнятими методиками, виготовляють зрізи за допомогою санного мікротома товщиною 5-7мкм, зрізи розправляють і швидко наклеюють на предметне скло з дистильованої води або 70% етанолу (при 45-50°), висушують в термостаті при температурі 37° протягом 1224год., депарафінізують за допомогою ксилолу (у двох порціях, протягом 2-3хв), переносять у низхідний ряд спиртів (96° - І; 96° - II; 80°; 60° - протягом 1хв. у кожному спирті), занурюють у 20% розчин аміакату срібла на 2-5хв, споліскують у двох змінах дистильованої води - по 1хв в кожній, дофарбують гематоксиліном Бйомера протягом 5хв, з наступним споліскуванням у дистильованій воді та перенесенням у водопровідну воду до появи інтенсивного синього забарвлення зрізу та переносять після споліскування у дистильованій воді у 0,5-1% спиртовий розчин еозину - 0,5-1хв, проводять через висхідний ряд спиртів (60°, 80°, 96°, абсолютний-І, абсолютний-ІІ) - по 1хв у кожному спирті, просвітлюють у дво х змінах ксилолу - по 3хв у кожному, заключають у канадський або піхтовий бальзам і покривають покривним склом і здійснюють мікроскопічне дослідження препаратів, при цьому спостерігають чорне забарвлення у місцях відкладання сечової кислота та її солей, при синьо-фіолетовому забарвленні ядер клітин і рожевому - цитоплазми, при цьому фарбуючий розчин аміакату срібла готують перед фарбуванням препаратів наступним чином: до 20мл 20% нітрату срібла додають 25% аміак до зникнення буро-коричневого осаду і появи легкої опалесценції, зберігають у темному посуді з притертим корком, перед використанням фільтрують. Зафарбовування сечової кислоти та її солей (уратів) у інтенсивно чорний колір пояснюється тим, що при взаємодії нітрату срібла з сечовою кислотою та її солями відбувається відновлення атомарного срібла, унаслідок чого місця відкладання та нагромадження цих сполук забарвлюються у інтенсивно чорний колір, ядра клітин фарбуються гематоксиліном у фіолетовий колір, а цитоплазма еозином у рожевий. Технічний результат способу обумовлений значним скороченням кількості маніпуляцій необхідних для виявлення сечової кислоти та її солей у порівнянні з відомим способом (прототипом), що дозволяє скоротити час проведення дослідження. Крім цього використовуються реактиви, які є дешевшими і більш доступними для придбання. При проведені патентного пошуку заявником виявлено технічне рішення (Кононский А.И. Гистохимия. - К.: Вища школа, 1976. - 278с.), яке містить найбільшу кількість суттєви х ознак, спільних із заявленим рішенням: відбір досліджуваного матеріалу під час біопсії, оперативного втручання або 6 автопсії, фіксацію його в абсолютному етанолі протягом 24год при двократній його зміні, зневоднення з використанням ацетону та бензолу, заливку в парафін та виготовлення гістозрізів за допомогою санного мікротома, наклеювання зрізів на предметні скла, депарафінування за допомогою ксилолу і перенесення препаратів у низхідний ряд спиртів, фарбування препаратів з використанням у фарбуючому розчині нітрату срібла, споліскування у дистильованій воді, дофарбовування препаратів з використанням спиртового розчину еозину, проведення препаратів через висхідний ряд спиртів та просвітлення у двох змінах ксилолу, покривання покривними скельцями з використанням прозорих смол, аналіз результатів мікроскопічного дослідження одержаних препаратів. Однак наявність зазначених спільних з прототипом, ознак є недостатня для одержання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб. Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію винаходу (корисної моделі) "новизна". У патентній і науково-технічній інформації не знайдено технічних рішень, у яких були б описані відомості про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від прототипу і забезпечують досягнення технічного результату: матеріал, який призначений для дослідження після фіксації у абсолютному етанолі переносять у три зміни безводного ацетону, протягом 1,5год у кожномій, а далі вносять його у суміш ацетон-бензолу (1:1) на 30хв і послідовно обробляють у двох змінах бензолу по 30хв у кожній, витримують у бензол-парафіні (1:1) при 38°С протягом 30-120хв, переносять у два розчини парафіну на 30-60хв в кожному при температурі 5354°С, заливають у парафін за загальноприйнятими методиками, виготовляють зрізи за допомогою санного мікротома товщиною 5-7мкм, зрізи розправляють і швидко наклеюють на предметне скло з дистильованої води або 70% етанолу (при 4550°), висушують в термостаті при температурі 37° протягом 12-24год, депарафінізують за допомогою ксилолу (у двох порціях, протягом 2-3хв), переносять у низхідний ряд спиртів (96° - І; 96° - II; 80°; 60° - протягом 1хв. у кожному спирті), занурюють у 20% розчин аміакату срібла на 2-5хв, споліскують у дво х змінах дистильованої води - по 1хв в кожній, дофарбують гематоксиліном Бйомера протягом 5хв, з наступним споліскуванням у дистильованій воді та перенесенням у водопровідну воду до появи інтенсивного синього забарвлення зрізу та переносять після споліскування у дистильованій воді у 0,5-1% спиртовий розчин еозину - 0,51хв, проводять через висхідний ряд спиртів (60°,80°,96°,абсолютний-І, абсолютний-ІІ) - по 1хв у кожному спирті, просвітлюють у двох змінах ксилолу - по 3хв у кожному, заключають у канадський або піхтовий бальзам і покривають покривним склом і здійснюють мікроскопічне дослідження препаратів, при цьому спостерігають чорне забарвлення у місцях відкладання сечової кислота та її солей, при синьо-фіолетовому забарвленні ядер клітин і рожевому - цитоплазми. 7 36706 Отже заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про його відповідність критерію винаходу (корисної моделі) "винахідницький рівень". Заявлений спосіб належить до галузі сільськогосподарської біології, зокрема ветеринарної патоморфології, а саме до способів гістохімічного виявлення продуктів метаболізму в клітинах, тканинах та органах тварин в нормі та за умов патології і може бути використаний в лабораторіях різних форм власності, які проводять гістологічні та гістохімічні дослідження, а тому відповідає критерію винаходу (корисної моделі) - "промислова придатність". Таким чином, заявлене технічне рішення є новим, промислово придатним, має винахідницький рівень, тобто відповідає всім умовам патентоспроможності винаходу (корисної моделі), відповідно до статті 7 розділу II Закону України "Про охорону прав на винаходи і корисні моделі" №1771111, 2000р. Заявлений спосіб здійснюється наступним чином: під час біопсії, оперативного втручання або аутопсії відбирають шматочки органів. Товщина шматочків не повинна перевищувати 1,5-2мм, площа їх може бути довільно (найкраще 1,52,5см 2). Не допускається фіксувати матеріал з ознаками автолізу. Ці шматочки фіксують в абсолютному етанолі протягом 24год. (можлива триваліша фіксація - навіть декілька тижнів і місяців; проте недоліком її є деформація тканин). При помутнінні спирту (фіксатора) його змінюють. Далі переносять у три зміни безводного ацетону, протягом 1,5-2год. у кожному. Занурюють у суміш ацетон-бензолу (1:1) - 30хв. Послідовно обробляють у двох змінах бензолу (30хв. у кожній). Витримують у бензол-парафіні (1:1) при 38° протягом 30-120хв. (допускається протягом 12год.). Переносять у дві зміни парафіну на 30-60хв. в кожному при температурі 53-54°С. Заливають у парафін за загальноприйнятими методиками. Виготовляють зрізи за допомогою санного мікротома товщиною 5-7мкм. Зрізи розправляють і швидко наклеюють на предметне скло з дистильованої води або 70% етанолу (при 50°). Висушують в термостаті при температурі 37° протягом 12-24год. Депарафінізують за допомогою ксилолу (у дво х порціях, протягом 2-3хв.). Переносять у низхідний ряд спиртів (96° - 1; 96° II; 80°; 60° - протягом 1хв. у кожному спирті). Переносять у розчин аміакату срібла на 2-5хв.; цей розчин готують таким чином: до 20мл 20% нітрату срібла додають 25% аміак до зникнення бурокоричневого осаду і появи легкої опалесценції. Зберігають в у темній посуді, перед використанням фільтрують. Споліскують у двох змінах дистильованої воли - по 1хв. в кожній. Дофарбують гематоксиліном Бйомера - 5хв. Споліскують у дистильо 8 ваній воді - декілька секунд. Переносять у водопровідну воду до появи інтенсивно синього забарвлення зрізу. Споліскують (декілька секунд) у дистильованій воді. Переносять у 0,5-1% спиртовий розчин еозину - 0,5-1 хв. Проводять через висхідний ряд спиртів (60°, 80°, 96°, абсолютний - І, абсолютний - ІІ) по 1хв. у кожному спирті. Просвітлюють у двох змінах ксилолу - по 3хв. у кожному. Заключають у канадський або піхтовий бальзам і покривають покривним склом. Результат: сечова кислота та її солі (урати) інтенсивного чорного кольору (при взаємодії нітрату срібла з сечовою кислотою та її солями відбувається відновлення атомарного срібла унаслідок чого місця відкладання та нагромадження цих сполук забарвлюються у інтенсивно чорний колір), ядра клітин синього кольору, цитоплазма - рожева. В умовах секційного залу та лабораторії кафедри патанатомії і гістології і лабораторії кафедри анатомії сільськогосподарських тварин Львівського національного університету ве теринарної медицини та біотехнологій ім. С.З. Гжицького проводився відбір матеріалу. Зокрема під час розтину, або за умов біопсійного дослідження, від курей, пітонів, свиней, собак та котів (всього 20 голів) відбирали шматочки нирок, печінки, серця, серцевої сорочки, підшлункової залози, наднирників, легень та інших органів. В одній групі фіксували матеріал в у 100% етанолі (прототип), занурювали в суміш ацетону і бензолу (1:1) - 30хв, проводили через три зміни ацетону - по 1,5год. у кожній, обробляли у двох змінах бензолу - по 30хв. у кожній, заливали у парафін і виготовляли зрізи за допомогою санного мікротома, і фарбували складним фіксуючим розчином, в склад якого шкодить гексамін, нітрат срібла та боратний буферний розчин, а у другій - новим, запропонованим нами, способом матеріал також фіксували у абсолютному етанолі, послідовно обробляли у дво х змінах бензолу, витримували у бензол-парафіні та заливали у парафін. Виготовляли зрізи за допомогою санного мікротома і фарбували. Склад запропонованого нами основного фарбую чого розчину був простішим: до 20% розчину нітрату срібла додавали 25% аміак (до зникнення буро-коричневого осаду і появи легкої опалесценції). Далі дофарбовували гематоксиліном та еозином, завдяки чому краще визначати різні гістологічні структури і диференціювати різні патологічні процеси, які виникають у клітинах, тканинах і органах. Процес виготовлення та фарбування препаратів, що виконувався новим способом був простішим, зручнішим, дешевшим та ефективнішим порівняно з прототипом. Порівняльний аналіз способів гістохімічного виявлення сечової кислоти та її солей, подано у таблиці 1. 9 36706 10 Таблиця 1 Технологія виконання різних способів гістохімічного виявлення сечової кислоти та її солей в органах і тканинах Прототип Вимагає: після фіксації у абсолютному етанолі, проводку матеріалу через: суміш ацетону і бензолу (1:1) - 30хв.; три зміни ацетону - по 1,5год. у кожній, дві зміни бензолу - по 30хв. у кожній. Надалі заливають у парафін і виготовляють зрізи за допомогою санного мікротома. Фарбуючий розчин виготовляють таким способом: до 100мл 3% розчину гексаміну додають 5мл 5% розчину нітрата срібла, після розчинення осаду до суміші додають 5мл боратного буферного розчину (рН=8). Буферний розчин готують таким чином: до необхідної кількості 3% борної кислоти додають одну краплю фенолфталеїну і титрують 1н. розчином NaOH до появи рожевого забарвлення, а потім додають дистильованої води до 200мл. Час фарбування 15-60хв. Для споліскування і просвітлення використовують розчин тіосульфату натрію протягом 3хв. Препарати дофарбовують лише еозином. Препарати заключають у полістерол. Таким чином, запропонований нами спосіб гістохімічного виявлення сечової кислоти та її солей Комп’ютерна в ерстка Д. Шев ерун Новий спосіб Після фіксації у абсолютному спирті матеріал переносять: у три зміни безводного ацетону - 1,5год. у кожному; суміш ацетон-бензолу (1:1)-30хв.; послідовно обробляють у двох змінах бензолу (30хв. у кожній). Надалі заливають у парафін і виготовляють зрізи за допомогою санного мікротома. У фарбуючому розчині не використовують гексамін та боратний буферний розчин. Реактив для виявлення сечової кислоти та її солей готують за такою схемою: до 20мл 20% нітрату срібла додають 25% аміак до зникнення буро-коричневого осаду і появи легкої опалесценції. Розчин фільтрують. Час фарбування 2-5хв. У зв'язку з цим, запропонований нами фарбуючий розчин є дешевшими, його простіше і швидше виготовляти. Розчин тіосульфату натрію не використовують, а споліскують у двох змінах дистильованої води по 1 хв. у кожній. Препарати спочатку дофарбовують гематоксиліном, а потім еозином. Завдяки цьому під час мікроскопічного дослідження краще визначати різні гістологічні структури і диференціювати різні патологічні процеси, які виникають у клітинах, тканинах і органах. Препарати заключають у канадський або піхтовий бальзам. Завдяки цьому їх краще досліджувати за допомогою мікроскопа (рідше у порівняні з полістеролом з'являються міхурці повітря) і вони довше зберігаються. (уратів), є більш ефективним в порівнянні з прототипом. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601