Антинеопластичний препарат

1. Антинеопластичний препарат, що виготовлений на основі глюконової кислоти, який відріз 3 37576 тіурамдисульфід («дисульфірам») [Induction apoptosis thiuramdisulfides, reactive metabolites dithiocarbamates, through coordinative modulation NFkappaB, з fos/c-jun, and p53 proteins: G.Y. Liu, et al.; Моl. Carcinog. 22, 235, 1998] галова кислота [Induction apoptosis gallic acid in lung cancer cells: У. Ohno, et al.; Anticancer Drugs 10, 845, 1999] епігалова кислота і її похідні [1. A new tumor promotion pathway and its inhibitors: H. Fujiki, et al.; Cancer Detect. Prev. 189, 1 (1994); 2. Inhibition tumor promoter-induced activator protein 1 activation and cell transformation tea polyphenols, (-)epigallocatechin gallate, and theaflavins: Z. Dong, et al.; Cancer Res. 57, 4414,1997] i галактозамін [D-galactosamine-induced mouse hepatic apoptosis: possible involvement with tumor necrosis factor, but not with caspase-3 activity; У. Itokazu, et al.; Biol. Pharm. Bull. 22, p.1127,1999]. Проте всі вони токсичні для організму в цілому і в клінічну практику не введені. Менш небезпечні цитостатичні антинеопластичні препарати, які уповільнюють, а нерідко і повністю пригнічують проліферацію (ріст) ракових пухлин (ор cit Ez-access kup oncology, р.3). Найбільш відомі з них: препарати платини (цис-платина, оксиплатина, карбоплатина); алкілувальні агенти (циклофосфамід, бусульфан, дакарбазин, тіотепа і ін.); антиметаболіти (цитарабин, фторурацил, метотрексат, меркаптопурин і ін.); рослинні препарати (доцетаксел, паклітаксел, вінкристин, вінбластин і ін.); гормональні засоби (хлормадінон, диетилстільбестрол, флутамід) і ін. Проте практично всі цитостатики гальмують дозрівання клітин крові, викликаючи анемію, тромбоцитопенію і нейтропенію, що погіршує стан пацієнтів. Тому відчувається гостра потреба в таких антинеопластичних препаратах, які б були практично нетоксичні для здорових клітин. Так, відомі препарати на основі інтерферону і специфічного білка, названого «ТНФ (туморнекротичний фактор)» [Возианов А.Ф., Бутенко А.К., Зак К.П. Цитокины. Биологические и противоопухолевые свойства. - Киев: Наукова думка, 1998]. Проте ТНФ діє через специфічні рецептори, які у ракових клітин нерідко працюють інакше, ніж у нормальних клітин. Тому практичне застосування ТНФ обмежено випадками, коли пухлини явно чутливі до нього (ор cit). Далі, технологія отримання ТНФ дуже трудомістка. І, нарешті, деякі цитокіни викликають помітні побічні ефекти, що обмежує їх застосування (ор cit). Таким чином, задача розробки загальнодоступних нетоксичних антинеопластичних препаратів широкого спектру дії, здатних індук увати апоптоз і пригноблювати проліферацію ракових клітин, залишається актуальною. Зокрема, відомий найближчий до корисної моделі по технічній суті препарат на основі глюконової кислоти, а саме глюконат кальцію. Встановлено, що він корисний при хіміотерапії злоякісних 4 новоутворень [Богуш Τ.Α., Смирнова Г.Б., Вихлянцева Η.Ο., Сыркин А.Б. Влияние глюконата кальция на токсичность и противоопухолевую активность доксорубицина у мышей. Антибиотики и химиотерапия, 2002]. Проте глюконат кальцію, узятий сам по собі, слабо гальмує ріст ракових пухлин. В основу корисноъ моделі положено задачу шляхом зміни складу створити такий препарат на основі глюконової кислоти, який при уведенні в людський організм проявляв би виражений антинеопластичний ефект на фоні збереження здорових клітин. Поставлена задача в першому варіанті вирішена тим, що антинеопластичний препарат на основі глюконової кислоти згідно з корисною моделлю являє собою щонайменше одну таку її сіль, в якій солетворний агент вибраний з групи, що складається з магнію, натрію, калію, gаміномасляної кислоти (далі ГАМК), етилендиаміну або їх сумішей. Дійсно, як буде показано далі на прикладах, практичне застосування будь-якої з можливих сполук глюконат-аніонів з вказаними речовинами, які мають лужні властивості, одночасно забезпечує проапоптозний і антипроліферативний ефект. Перша і друга додаткові відмінності відповідно полягають в тому, що антинеопластичний препарат є глюконатом магнію, або калію. Їх бажано застосовувати при онкологічних захворюваннях довільної етіології на фоні дефіциту в організмі іонів калію або магнію. Поставлена задача в другому варіанті вирішена тим, що антинеопластичний препарат на основі глюконової кислоти згідно з корисною моделлю є координаційною сполукою на основі глюконата магнію, в якій ліганди вибрані з групи, що складається з ГАМК, 3-гідрокси-ГАМК, етилендиамінтетраоцтової кислоти (далі ЕДТА) і етиленглікольтетраоцтової кислоти (далі ЕГТА). Ці препарати бажано застосовувати при неопластичних змінах епітеліальної тканини, особливо на фоні дефіциту в організмі іонів магнію. Додаткова відмінність полягає в тому, що антинеопластичний препарат представлений координаційною сполукою диГАМК-Мg-глюконат, який бажано застосовувати при онкологічних захворюваннях органів дихання, головного мозку і кишечнику. Поставлена задача в третьому варіанті вирішена тим, що антинеопластичний препарат являє собою подвійну сіль, вибрану з групи, що складається з бутиратоглюконату магнію, оксибутиратоглюконату магнію, глюкаратоглюконату магнію, бутиратоглюконату кальцію, оксибутиратоглюконату кальцію, глюкаратоглюконату кальцію і їх комбінацій. Ці препарати бажані при неопластичних процесах на фоні дефіциту в організмі іонів магнію або кальцію. Додаткова відмінність полягає в тому, що антинеопластичний препарат представлений глюкаратоглюконатом магнію, який доцільно застосовувати при онкологічних захворюваннях довільної етіології на фоні дефіциту в організмі іонів магнію. 5 37576 Далі суть корисної моделі пояснюється: - описом способів отримання препаратів на основі глюконової кислоти згідно з корисною моделлю та їх експериментальних лікарських форм. - описом експериментів на моделях in vitro і отриманих результатів у порівнянні з результатами дії загальноприйнятих антинеопластичних препаратів. - попередніми методичними рекомендаціями по застосуванню препаратів згідно з корисною моделлю для лікування онкологічних захворювань. 1) Способи отримання препаратів згідно з корисною моделлю Глюконова кислота (емпірична формула С6Н12О7) як така, глюконат магнію (емпірична формула дигідрату С 12Н22 МgО11*2Н2O), Г АМК (емпірична формула C4H9NO2), 3-гідрокси-ГАМК (емпірична формула С 4H9NО3), ЕДТА (емпірична формула С10Н20 О10N2), ЕГТА (емпірична формула C14H24N2 O10) і глюкарова кислота (емпірична формула C6H8O8) доступні на ринку як хімічні реактиви, які для здійснення корисної моделі повинні мати якість не нижче «хч» (хімічно чисті). За бажанням глюконат магнію можна отримати нейтралізацією глюконової кислоти (звичайно узятої у вигляді водного розчину d-глюконолактона, що легко гідролізується) практично еквімолярною кількістю оксиду (або гідроксиду) магнію. Нормальні солі глюконової кислоти одержують реакцією нейтралізації, зокрема, внесенням розрахункової кількості лужної (або амфотерної сполуки) в (звичайно водний) розчин кислоти. Цільові продукти виділяють, як правило, випаровуванням розчинника і сушкою залишку до постійної маси (і, за бажанням, додатковою перекристалізацією). Координаційні сполуки глюконату магнію одержують з глюконату магнію і джерела вибраного ліганду таким чином. Спочатку в дистильованій воді при перемішуванні і нагріванні на водяній бані поволі розчиняють певну кількість (наприклад, 0,1моля) глюконату магнію. Розчин охолоджують до температури 35-40°С і поступово при перемішуванні вводять розрахункову кількість ліганду в мольному відношенні до глюконату магнію 2:1. Готовий продукт виділяють з розчину розпилювальною сушкою. В синтезі координаційних сполук глюконату магнію з ЕДТА або ЕГТА використовують розчини кислот в мольному співвідношенні 1:2 або 1:3 по відношенню до глюконової кислоти з додаванням в реакційну суміш розрахункової кількості солі магнію. Сполуку виділяють перекристалізацією із спирту. Так були отримані сполуки наступного складу: Мg2(С10H20 О10N2)(С6Н12 O7) 2 (Мg3(С10Н20 О10N2)(С6Н12 O7) 3ОН) Мg2(С14H24N2 O10)(С6Н12 O7) 2 і (Мg3(С14Н24 О10)(С6Н12 О7)3 ОН). Ці сполуки можуть містити іони натрію або калію як протиіони. ДиГАМК-Мg-глюконат (емпірична формула дигідрату С20Н38 МgN2O18*2H2O) одержують розчиненням глюконату магнію у воді при нагріванні на водяній бані. Після охолоджування розчину до 3540°С додають при перемішуванні розрахункову 6 кількість ГАМК в мольному відношенні до глюконату магнію 2:1. Цільовий продукт виділяють розпилювальною сушкою. Координаційні сполуки глюконату кальцію одержують з глюконату кальцію і відповідного ліганду по схемі, яка аналогічна наведеній вище. Для синтезу координаційних сполук глюконату кальцію з ЕДТА або ЕГТА використовують розчини цих кислот в мольному співвідношенні 1:2 або 1:3 з розрахунку на глюконат-аніон і додають в такий розчин розрахункову кількість глюконату кальцію. Продукти виділяють перекристалізацією з етанолу. Так були отримані сполуки наступного складу: Ca2(С10Н20О 10N2)(С6Н 12O 7)2 (Ca3(С10Н20О 10N2)(С6Н 12O 7)3 ОН) Са2(С14Н24N2O 10)(С6Н 12O 7)2 і (Са3(С14Н24N2O 10)(С6Н 12O 7)3 ОН). Ці сполуки можуть містити іони натрію або калію як протиіони. Подвійні солі магнію одержують таким чином. Спочатку готують практично 50% водний розчин еквімолярної (з розрахунку на катіон) суміші глюконової і однієї з вказаних вище (масляної, або оксимасляної, або глюкарової) кислот. В отриманий розчин при інтенсивному перемішуванні поступово вводять еквімолярну кількість оксиду (або гідроксиду) магнію. Після засвоєння джерела магнію реакційну суміш охолоджують на крижаній бані, залишки води відділяють на фільтрі Шота, а осад суша ть до постійної маси. Подвійні солі глюконату кальцію одержують по аналогічній схемі. Експериментальні лікарські форми були виготовлені розчиненням вказаних сполук в ізотонічному водному розчині хлориду натрію або глюкози. 2). Експерименти на лабораторних моделях ракових культур. Ефективність антинеопластичних препаратів згідно з корисною моделлю вивчали на культурах (лабораторних лініях) ракових клітин трьох видів: А-549 (клітини, отримані біопсією великоклітинної ракової пухлини легенів людини), A-549-R (клітини того ж типу, резистентні до інтерферону в концентрації 10000М0/мл) і U-937 (клітини, чутливі до відомих індукторів апоптоза). Контролем служили здорові клітини тих же тканин, не піддані дії антинеопластичних препаратів. Клітини кожної вказаної лінії і відповідні здорові клітини культивували при 37°С в повному живильному середовищі RPMI-1640 (фірма SIGMA, США) з добавками 2мМ L-глютаміну, 10% ембріональної сироватки і 40мкг/мл гентаміцину в зволоженій атмосфері з об'ємною концентрацією СO2 5%. Вказане середовище замінювали кожні 2-3 діб. Після формування щільного моношару клітин на субстраті (на 4-5 добу зростання) готували клітинні суспензії і засівали ними 24-лункові планшети в концентрації 3×104 клітин на одну лунку. Контрольний препарат доксорубіцин і препарати згідно з корисною моделлю, вказані в Таблиці в кінці тексту, застосовували у вигляді добавок до рідких живильних середовищ в однаковій концентрації 10-3мМ/л. В ході експериментів живильне середовище замінювали щодоби. 7 37576 Для візуального розрізнення живих і мертвих клітин їх фарбували трипановим синім. Облік клітин, що вижили, проводили на гемоцитометрі через 24 години, 48 годин і 72 години, виходячи з фактичної кількості живих клітин на початок кожної відповідної доби. Встановлено, що всі випробувані сполуки на основі глюконової кислоти у принципі (хоча і різною мірою) придатні для лікування і профілактики онкологічних захворювань. Дійсно, з Таблиці виходить, що ці сполуки одночасно проявляють відносно культур ракових клітин антипроліферативну активність і проапоптотозну активність, але не зачіпають здорові клітини. Природно, що частина препаратів згідно з корисною моделлю проявляє або переважно антипроліферативну активність, або переважно проапоптотозну активність і що сукупний антинеопластичний ефект залежить як від виду пухлини, так і від складу і структури препарату і від його концентрації і/або тривалості дії на пухлинні клітини. Проте диГАМК-Мg-глюконат, ди-3гідроксиГАМК-Мg-глюконат, диГАМК-Са-глюконат, ди-3-гідроксиГАМК-Са-глюконат, бутиратоглюконат магнію і бутиратоглюконат кальцію проявили досить урівноважену і явно виражену антипроліферативну і проапоптотозну активність. Ці ж сполуки мають дуже низьку токсичність. Так, шляхом стандартних експериментів на щурах було встановлено, що їхня LD50 не менше 700мг/кг (а для диГАМК-Мg-глюконата - приблизно 3000мг/кг). Тому їх можна застосовувати в дуже високих разових, добових і курсових дозах до успіху без помітного ризику ускладнень. Разом з описаними вище і вра хованими в Таблиці серійними експериментами на двох лініях ракових клітин А-549 і U-937 була вивчена залежність антинеопластичної ефективності диГАМКМg-глюконата від його концентрації в клітинній суспензії. Типові приклади таких досліджень стисло описані нижче. Приклад 1. Клітинні суспензії на базі лінії А549 були отримані і посіяні в чотири 24-лункові планшети в концентрації 3×104 клітин на одну лунку, як описано вище. ДиГАМК-Мg-глюконат вносили в живильні середовища в розведеннях 10 -1, 10-2, 10-3 і 10-4мМ/л. Було встановлено, що в розведенні 10-1мМ/л цей препарат вже через 24 години викликає загибель 85% ракових клітин, а в мінімальному розведенні 10-4мМ/л протягом 72 годин забезпечує за 8 гибель 50% ракових клітин від їхньої первинної кількості. Приклад 2. Клітинні суспензії на базі лінії U937 були отримані і посіяні в чотири 24-лункові планшети в концентрації 3×104 клітин на одну лунку, як описано вище. ДиГАМК-Мg-глюконат вносили в живильні середовища в розведеннях від 10-1 до 10-4мМ/л. Було встановлено, що в розведенні 10-1мМ/л цей препарат вже через 24 години викликає загибель 95% ракових клітин, а в мінімальному розведенні 10-4мМ/л протягом 72 годин забезпечує загибель 60% ракових клітин від їх первинної кількості. В контролі на суспензіях здорових клітин було встановлено, що їх загибель під дією диГАМК-Мдглюконата в розведенні 10-1мМ/л протягом 72 годин не перевищила 7%, тобто на рівні допустимої погрішності оцінки. 3) Попередні методичні рекомендації по застосуванню препаратів згідно з корисною моделлю для лікування онкологічних захворювань Запропоновані препарати на основі глюконової кислоти можна застосовувати для профілактики і лікування неопластичних процесів. Профілактичне застосування препаратів особливо виправдано на фоні імунодефіциту довільної етіології. Можна припустити, що ці препарати будуть найбільш ефективні при ракових захворюваннях легень, головного мозку, нирок і шлунковокишкового тракту (особливо при парентеральному або пероральному застосуванні). У разі ракових захворювань шкіри можливо їх місцеве (локальне) застосування (зокрема, у вигляді аплікацій розчинів, мазей чи лініментів, або трансдермально). Застосування препаратів згідно з корисною моделлю в клінічній практиці може поєднуватися із загальноприйнятою хіміо- або інтерферонотерапією. Таке поєднання особливо корисне на фоні розвитку резистентності пухлинної тканини до інтерферонів. Антинеопластичні препарати згідно з корисною моделлю можуть бути легко виготовлені промисловим шляхом і використані для профілактики і амбулаторного або клінічного лікування онкологічних захворювань. Вони легко засвоюються і практично нешкідливі для людського організму навіть в таких разових дозах, які значно перевищують терапевтично необхідні дози. 9 37576 10 Таблиця Антипроліферативна та проапоптозна активність препаратів на культурах ракових клітин in vitro (вказано кількість життєздатних клітин в %) Експозиція, годин Випробовувані препарати Контроль Доксорубіцин Глюконова кислота Глюконат магнію Глюконат калію Етилендиамінглюконат ГАМК-глюконат ДиГАМК-Мg-глюконат Ди-3-гідрокси ГАМК-Мg-глгоконат Координаційна сполука ЕДТА-Мg2диглюконат Координаційне сполука ЕГТА-Мg2диглюконат Координаційне сполука ЕДТА-Мg3триглюконат Координаційне сполука ЕГТА-Мg3триглюконат Бутиратоглюконат магнію Оксибутиратоглюконат магнію Глюкаратоглюконат магнію ДиГАМК-Са-глюконат Ди-3-гідроксиГАМК-Са-глюконат Координаційне сполука ЕДТА-Са2 диглюконат Координаційне сполука ЕГТА-Са2диглюконат Координаційне сполука ЕДТА-Са3триглюконат Координаційне сполука ЕГТА-Са3триглюконат Бутиратоглюконат кальцію Оксибутиратоглюконат кальцію Глюкаратоглюконат кальцію Комп’ютерна в ерстка М. Ломалова Тип культури ракових клітин A-549-R 72 24 48 72 24 24 Α-549 48 U-937 48 72 100 60 80 50 60 40 50 40 50 100 50 80 50 60 50 50 45 45 100 40 70 60 70 50 60 55 50 100 60 80 50 60 40 50 40 50 100 50 80 50 60 50 50 40 45 100 50 70 60 70 50 60 55 50 100 40 80 50 60 40 50 10 50 100 50 80 50 60 50 50 20 45 100 50 70 60 70 50 60 35 50 50 40 40 50 40 40 50 40 40 35 40 40 35 40 40 70 80 70 40 40 50 40 40 50 60 50 65 30 40 40 30 40 40 60 60 60 40 50 60 60 50 50 50 50 50 50 40 45 50 50 55 40 50 50 60 55 50 50 40 50 50 40 45 40 50 55 60 50 60 60 55 60 50 60 50 50 60 45 50 50 55 40 50 50 40 70 90 40 70 90 30 40 50 30 70 70 60 80 75 40 40 50 40 40 50 60 40 50 40 50 70 40 50 40 60 65 70 40 50 60 50 50 70 50 60 70 40 50 60 50 50 70 50 60 70 40 50 60 30 50 70 40 60 70 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601