Спосіб визначення факторів патогенності штамів f.tularensis in vitro

Спосіб визначення факторів патогенності штамів F.tularensis in vitro, що включає виділення, культивування, зараження клітин периферійної 3 37715 Останнім часом дослідження факторів патогенності туляремійних мікробів і особливостей їх взаємодії з клітинами природного захисту та імунної системи проводяться на моделі одного типу клітин ПКД моноцитів-макрофагів. Порівняльне вивчення взаємовідношень вакцинного штаму LVS з макрофагами людини та миші показало, що штам LVS розмножується як в макрофага х людини, так і в мишачих макрофагах, проте, секреція прозапальних цитокінів індукується лише в макрофагах людини [10]. Виявлені відмінності підтверджують факт неоднакової експресії факторів патогенності туляремійних мікробів в клітинах високочутливи х та відносно малочутливих організмів, однак, причини відмінної реакції клітин цих організмів не встановлені. До недоліків даної експериментальної моделі можна віднести: 1) використання лише одного типу клітин неспецифічного захисту - моноцитів-макрофагів; 2) застосування лише вакцинного штаму збудника; 3) відсутність досліджень морфологічних змін заражених макрофагів. Також не були встановленими фактори патогенності, відповідальні за виявлені відмінності. Відомим є спосіб виявлення факторів патогенності штамів F.tularensis для людини з морфологічних ознак (прототип), який характеризує взаємодію живих та вбитих формаліном туляремійних бактерій з моноцитамимакрофагами ПКЛ [11]. Спосіб здійснювали наступним чином. Мононуклеарні клітини виділяли з крові здорових донорів центрифугуванням в градієнті щільності фікола-діатризоата та інкубували 5 діб при 37°С в середовищі RPMI 1640 з 20% аутологічної сироватки для диференціації моноцитів у макрофаги (1,5х106 клітин /покривне скельце). Потім клітини інкубували протягом ночі в свіжому середовищі с 10% аутологічної сироватки, заражали атенуйованим штамом LVS або вірулентним штамом RCI (F.tularensis tularensis) з множинністю інфекції 35:1(бакт./моноцит). В різні терміни від 0 до 8 годин, препарати фарбували сироваткою люмінесцуючою до ліпополісахариду F.tularensis, до глікопротеїнів, асоційованих з мембранами ранніх ендосом і лізосом, катепсину D, а також лізосомотропним агентам, досліджували за допомогою конфокального скануючого мікроскопу. Для електронно-мікроскопічного дослідження клітини заражали штамом LVS або RCI з множинністю інфекції 500:1, 200:1 и 50:1(бакт./клітину) і за 3, 6, 14 годин досліджували в трансмісивному електронному мікроскопі. Встановили: 1) наявність туляремійних мікробів в неокисленій фагосомі моноцитів-макрофагів на ранніх строках після зараження; 2) руйнування мембрани фагосоми, в якій знаходяться бактерії, і наявність електронно-прозорої зони по периферії внутрішньоклітинних бактерій, 3) живі мікроби вірулентного і атенуйованного штаму, на відміну від вбити х, транзиторно знаходяться в неокисленій фагосомі, мембрана якої вміщує на цитоплазматичному боці фібрілярні 4 структури і піддається руйнуванню, дозволяючи туляремійним бактеріям проникати в цитоплазму клітини. Автори не виявили помітної різниці між ушкоджуючою дією високовірулентного штаму RCI і вакцинного LVS та зробили висновок про існування інших факторів, критичних для вірулентності F.tularensis. Недоліками способу-прототипу є: 1) технічна складність, трудомісткість та багатоетапність досліджень; 2) тривалість дослідження (6-7 діб); 3) дороговизна використовуваних матеріалів та складного технічного обладнання; 4) в моделі використаний тільки один тип клітин запалення та імунної системи ПКЛ; 5) неможливість виявлення різниці між вірулентним та вакцинним штамами. Методичні складності, тривалість дослідження і значні економічні витрати суттєво обмежують можливості виявлення факторів патогенності та оцінки вірулентності штамів F.tularensis для людини вищенаведеним способом. В основу запропонованої корисної моделі поставлена задача удосконалити методичні прийоми виявлення факторів патогенності F.tularensis для людини, підвищити інформативність, скоротити економічні затрати і строки дослідження. Поставлена задача вирішується таким чином, що використовують пул лейкоцитів ПКЛ, який містить основні типи клітин запалення та імунної системи, які заражають безпосередньо після виділення, сокультивують з туляремійними мікробами протягом 2-24 годин, фіксують та фарбують різними барвниками, визначають клітинимішені. Характер та ступінь цитоморфологічних змін встановлюють за ознаками прискорення та посилення інтенсивності розвитку апоптозу нейтрофілів, деструкції моноцитів-макрофагів, наявності цитоскелетів мононуклеарних фагоцитів. Заявлений спосіб виконується наступним чином: 1. виділяють пул лейкоцитів з гепаринизованої крові здорових донорів осаджуванням 3,3 % желатини; 2. обробляють 0,17 молярним розчином NFLtCl, двічі промивають забуференим фізіологічним розчином; 3. вносять 3-5х105 клітин в 0,05мл фізіологічному розчині на поверхню покривного скельця всередині пеніцилінового флакону; 4. інкубують при 37°С 30 хвилин; 5. вносять на моношар клітин 0,1 мл суміші туляремійних мікробів досліджуваного штаму з множинністю зараження 50 мікробних тіл/клітину та продовжують інкубува ти протягом 1 години при 37°С; 6. вносять по 1,5мл середовища 199с 10% телячої ембріональної сироватки (ТЕС) та співкультивують клітини і мікроби 1 годину; 7. видаляють неприкріплені мікроби двократним промиванням в середовищі 199; 8. додають середовище 199с 10% телячої ембріональної сироватки (ТЕС) та інкубують при 37°С; 5 37715 9. препарати фіксують через 4, 8, 24 години інкубації розчином Буена або холодним метиловим спиртом та фарбують відповідно гематоксилін-еозином, за Романовським-Гімза чи протитуляремійними флуоресцуючими імуноглобулінами; 10. препарати досліджують в світловому та люмінісцентному мікроскопах і визначають морфофункціональні зміни клітин ПКЛ на різних етапах взаємодії, присутність туляремійних мікробів та їх зв'язок з клітинами ПКЛ в період адсорбції і проникнення збудника (через 4 години), його репродукції (8-24 години). Туляремійні мікроби виявляють фарбуванням за Романовським-Гімза, їх специфічність встановлюють після фарбування протитуляремійною люмінісцуючою сироваткою, а характер цитодеструктивних змін визначають на препаратах, фарбованих гематоксилін-еозином та за РомановськимГімза. При оцінці факторів патогенності і особливостей імунопатогенезу у людини враховують наступні ознаки. Визначають клітини-мішені для досліджуваного штаму за здібністю клітин рецептувати та фагоцитува ти бактерії. Нами встановлено, що основними клітинами-мішенями для атенуйованого штаму є нейтрофіли, а для вірулентних штамів -моноцити-макрофаги. Визначають характер та ступінь цитодеструктивних змін клітин ПКЛ. Показано, що на ранніх етапах (4 години після зараження) зміни структури клітин відзначаються тільки при зараженні вірулентими штамами (Табл.1). У нейтрофілах спостерігаються початкові стадії апоптозу: тісна асоціація сегментів ядер, початок їх злиття (Табл. 1,1-ІІІ), вакуолізація і розрідження цитоплазми (Табл. 1, IV-V), а в окремих моноцитах-макрофагах деструкція (гомогенізація) структури ядра. Найбільш демонстративні відмінності між вакцинним і вірулентним штамами спостерігаються через 8 і 24 години після зараження (Табл. 1). У більшої частини нейтрофілів у присутності вірулентного штаму ядро є пікнотичним - кінцева стадія апоптозу, а цитоплазма вакуолізована та розріджена. Хроматин в ядрах багатьох моноцитів-макрофагів гомогенізований чи агрегований і виходить за межі ядра і цитоплазми, при цьому зберігаються тільки фіброзні тяжі-цитоскелети. Характерною особливістю моноцитів-макрофагів після зараження вірулентним штамом є утворення ними довгих мікровиростів-тяжів, часто асоційованих з туляремійними мікробами. На кінці окремих мікровиростів утворюється колбовидне потовщення з туляремійними мікробами, яке має тісний контакт з іншими макрофагами або лімфоцитами. 6 В присутності вакцинного штаму гомогенізація хроматину суттєво меншої кількості ядер макрофагів відбувається через 24 години. Більшість нейтрофілів піддається цитолізу, а більша частина макрофагів зберігає свою стр уктуру та утворює кластери (Табл.1), що свідчить про збереження ними функціональної активності. Отримані дані вказують на те, що в період репродукції вірулентного штаму F.tularensis в моноцитах-макрофагах (4 години, частіше 8-24 години після зараження) утворюються токсичні молекули, які викликають цитодеструктивні зміни не тільки цих клітин, але і присутніх на моношарі нейтрофілів. Апоптоз нейтрофілів є найбільш демонстративним індикатором інтенсивності синтезу вказаних молекул. Посилення швидкості та інтенсивності апоптозу можна розцінювати як морфологічний еквівалент токсичності - мірою вірулентності. Цитоліз нейтрофілів через 24 години при заражені вакцинним штамом, пов'язаний з фагоцитозом туляремійних мікробів. Апоптоз нейтрофілів та деструкція моноцитівмакрофагів є основними проявами факторів патогенності вірулентних штамів F.tularensis, їх варіації відображають ступінь вірулентності досліджуваного штаму, а ушкодження функцій нейтрофілів та макрофагів -послаблення протиінфекційного захисту. Дані, які підтверджують можливість здійснення корисної моделі. Приклад 1. Вакцинний штам №15: 1) вирощують при 37°С протягом двох діб на туляремійному середовищі (FT), готують суміш туляремійних бактерій в фізіологічному розчині. За допомогою стандарту мутності визначають концентрацію бактерій в 1мл і розводять до концентрації 1-2х10/мл; 2) лейкоцити виділяють з гепаринизованої ПКЛ 3,3% желатином, оброблюють 0,17 молярним розчином NI-LtCl, двічі промивають забуференим фізіологічним розчином, визначають в камері Горяєва кількість клітин в суспензії лейкоцитів і разводять до концентрації 6-8х106 клітин в 1 мл, на поверхню покривного скельця в пеніцилінових флаконах наносять 0,1 мл суміші клітин та інкубують 30 хвилин при 37°С; 3) клітини заражають з множинністю інфекції 50 мт/клітину, продовжують інкубувати 1 годину, вносять 1,5 мл середовища 199 с 10% ТЕС і співкультивують клітини і бактерії ще 1 годину, неприкріплені бактерії видаляють двократним промиванням в середовищі 199; 4) через різні строки (2, 4, 8, 24 години) співкультивування мікробів і клітин (по 2 скельця на кожен строк 7 37715 8 Табл 1 Диференційні ознаки реакції клітин ПКЛ на вірулентні та вакцинні штами F.tularensis Час після Клітиназараження мішень 4 нейтрофіли Вірулентні штами Вакцинний штам Змін немає моноцитимакрофаги нейтрофіли Початкова стадія апоптозу Зміни незначні Утворення цитоскелетів клітин Гомогенізація ядер лише частини моноцитівмакрофагів нейтрофіли Апоптоз, пікноз ядра Цитоліз нейтрофілів моноцитимакрофаги 24 Змін немає моноцитимакрофаги 8 Деструкція (гомогенізація) структури ядра Туляремійні бактерії у фрагментах цитоплазми зруйнованих макрофагів Кластеризація та спосіб фарбування) препарати фіксують розчином Буена або холодним метиловим спиртом, фарбують відповідно гематоксилін-еозином, за Романовським-Гімза чи протитуляремійними люмінесцуючими імуноглобулінами; 5) препарати досліджують в світловому і люмінесцентному мікроскопах і визначають ознаки, що характеризують особливості взаємодії вакцинного штаму F.tularensis з лейкоцитами ПКЛ; 6) встановлюють здатність туляремійних бактерій адсорбуватися та проникати переважно в нейтрофіли ; 7) слабке посилення апоптозу ядер нейтрофілів і початок гомогенізації хроматину невеликої кількості ядер макрофагів спостерігають через 8 годин після зараження (табл.), а через 24 години - деструкцію нейтрофілів, збереження і кластеризацію моноцитів-макрофагів. Приклад 2. Досліджували вірулентний штам (природний ізолят) №56 F.tularensis. Фактори патогенності вірулентних штамів F.tularensis досліджують як в прикладі №1, пункти 1-5. 9 37715 Встановлюють здатність туляремійних бактерій адсорбуватися на моноцитахмакрофагах, проникати в них, прискорювати та посилювати процес апоптозу ядер нейтрофілів, гомогенізацію хроматину ядер моноцитівмакрофагів на ранніх строках після зараження (4 години). Через 8 і 24 години після зараження виявляють різке посилення апоптозу нейтрофілів, вакуолізацію і розрідження їх цитоплазми, появу цитоскелетів моноцитів-макрофагів та довги х цитоплазматичних тяжів. Кластери моноцитівмакрофагів відсутні. Наявність комплексу описаних ознак дає основу віднести досліджуваний природний ізолят F.tularensis до вірулентних штамів. Таким чином, заявлена модель дозволяє визначати фактори патогенності F.tularensis, диференціювати вірулентні і вакцинні штами, виявляти механізми розселення збудника, імунопатогенезу туляремії, пригнічення захисних функцій клітин запалення та імунної системи людини. Окрім підвищення інформативності способу, його застосування спрощує технологію досліджень, скорочує строки на 5-6 діб, виключає необхідність застосування вартісної апаратури та реагентів. Заявлене технічне рішення може бути використано для виявлення факторів патогенності модифікованих штамів F.tularensis та інших внутрішньоклітинних патогенів, а також для оцінки і відбору ефективних та безпечних вакцин, антитоксичних та антибактеріальних препаратів на доклінічній стадії випробування, розробки нових патогенетичних стратегій профілактики та лікування туляремії. Джерела інформації: 1. Petersen J.M., Schriefer M.E. Tularemia: emergence/re-emergence // INRA, EDP Sciences, 2005.- Vet. Res. 36 (2005).- 455-467. 2. McLendon M.K., Apicella M.A., Alien L-A.H. Francisella tularensis: taxonomy, genetics, and immunopatogenesis of a potential agent of biowarfare// Annu Rev Mikrobiol.- 2006 ; 60: P. 167-185. Комп’ютерна в ерстка Д. Шев ерун 10 3. Dennis D., Ingleslby Т., Henderson D.A. Tularemia as a Biological Weapon: Medical & Public Health Management // IAMA, 2001, v. 285, № 21. - P. 2763-2773. 4. Ellis J., Oyston P.C.F., Green M., Titball R. Tularemia // Clinical Microbiol. Reviews, Oct. 2002, p.631-646. 5. R. Titball, A. Johansson, M. Forsman. Will the enigma ofFr. tularensis virulence soon be solved // Trends in Microbiology, 2003. - Vol. 11, № 3. 6. Fortier A.H., Polsinelli Т., Green S.J., Nacy C.A. Acti vation of macrophages for destruction of Francisella tularensis: identification ofcytokines, effectors molecules // Infect. & Immun., Mar. 1992.-P. 817825. 7. Golovlev I., Ericsson M., Sandstrom G., Tarnvik A., Sjostedt A. Identification of Francisella tularensis Induced during Growth in Macrophages and Cloning of the Gene Encoding a Prominently Induced 23Kilodalton Protein // Infect & Immun., June 1997.- P. 2183-2189. 8. Павлович Н.В., Аронова Н.В., Оноприенко Н.Н. и др. Видо- и родоспецифические антигенные эпитопы липолисахаридов Fr. tularensis //Молекул, генетика, микробиол. и вирусол., 2003. - № 3. - С. 7-12. 9. Poquet Y., Kroca M., Halary F. et. al. Expansion of V 9V 2 Т cells is triggered by Francisella tularensis-derived phosphoantigens in Tularemia but not Tularemia Vaccination // Infect. & Immun., Ma y, 1998. - P. 2107-2114. 10.Bolder C.E., Forestal C.A., Italo J.K. et.al.// J.Leukoc. Biol. - 2005. Vol. 77. - P.893-897. 11. Clemens D. L., Lee B.J., Horwitz M.A. Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages // Inject, and Immun. - 2004. - Vol. 72. - № 6. - P. 3204 - 3217. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601