Імуноферментна діагностична тест-система “trichineliso test ab” для виявлення антитіл до trichinella spiralis у ссавців

1. Імуноферментна діагностична тест-система "Trichineliso test AB" для виявлення антитіл до 3 37758 4 проводити дослідження сироваток крові живих ген, до лунок полістиролових планшетів де знахотварин та міжм'язової рідини заморожених туш на диться адсорбований антиген Trichinella spiralis трихінельоз. вносять досліджувані зразки сироваток або плазми Відома реакція мікропреціпітації на живих ликрові при цьому специфічні до антигену антитіла чинках трихінел [Бессонов А.С. Диагностика тризв'язуються з антигеном на твердій фазі, утворюхинеллеза. Вильнюс, "Минтис", 1975, - с.383]. ючи комплекси антиген-антитіло, після відмивання Принцип реакції полягає в тому, що живі личинки антитіл, що не зв'язались, в лунки планшетів вночи статевозрілі трихінели, які вміщені в гомологічсять імуноферментний кон'югат, позначений перону імунну сироватку, при температурі 37-40°С виксидазою, який зв'язується з комплексами антигенділяють продукти життєдіяльності (секрети і ексантитіло, а після інкубації та відмивання непов'якрети), котрі преципітуються антитілами імунної заного кон'югату, в лунки додають субстрат пероксироватки, створюючи преципітати, які чітко видно сидази перекис водню та хромоген - ортофеніленпід мікроскопом. діамін, пероксидазну реакцію зупиняють, додаючи Негативна сторона методу полягає в тому, що 2М розчин сірчаної кислоти, і вимірюють оптичну в реакції використовують живих личинок або стагустину суміші в лунках, яка при довжині хвилі світевозрілих трихінел, які можуть бути небезпечнитла 492нм та 620нм пропорційна концентрації спеми для виконавців реакції, трудомісткість їх одерцифічних антитіл у досліджуваних зразках. жання та зберігання, недостатня специфічність, Недоліком цієї тест-системи її трудомісткість і ефективність та візуальний облік реакції. складність. Дослідження є менш чутливими і не Відома реакція ензимом мічених антитіл для підлягають електронному протоколюванню редіагностики трихінельозу [Белозеров С.Н. Гуданазультатів. вичус Т.Н. Реакция ензимом меченых антител для На сьогодні не існує жодної комерційної унідиагностики трихинеллеза. Ж. "Ветеринария", версальної тест-системи для визначення антитіл 1982, Изд. "Колос" М. - С.41-44]. Принципова схедо Trichinella spiralis у різних видів ссавців. В оснома відтворення цієї реакції полягає в тому, що в вному тест-системи направлені на виявлення анлунки мікропланшета для імунологічних дослітитіл у окремих видів ссавців -свині, коні, м'ясоїдні, джень одноразового використання, які виконують гризуни, тощо або людина. Це обумовлено консроль інертного носія антигену і антитіл, послідовно трукцією одного з критичних компонентів тествносяться розчинний антиген, дослідна сироватка системи, під назвою - пероксидазний кон'югат. крові з припустимою наявністю антитіл, кон'югат і Тобто, в тест-системі видової належності присутні субстрат. Кон'югат це розчин антивидових антитіл, так звані антивидові кон'югати, а в тест-системі, мічених ферментом пероксидазою хрону, субстрат що заявляється сконструйований пероксидазний - суміш 0,08%-ий 5-аміносаліцюювої кислоти з кон'югат котрий може виявляти антитіла майже 0,05%-ого перекису водню у відношенні 9:1. В яковсіх ссавців (мається на увазі наземних тварин і сті антигену використовується трихінельозний людини). фракціонований антиген, що готується із свіжоВ основу корисної моделі поставлено задачу одержаних або ліофілізованих личинок трихінел. створення імуноферментної тест-системи для виАнтиген одержують в 2 етапи, спочатку готується явлення антитіл до Trichinella spiralis у різних видів цільний екстракт личинок трихінел, потім він фрассавців, що дозволяє виявляти антитіла майже кціонується методом гель-хроматографії на сефавсіх ссавців шля хом сконструйованого пероксидадексі G-200. зного кон'югату, завдяки чому система забезпечує Створений в процесі постановки реакції комвиявлення антитіл проти антигенів Trichinella spiплекс антиген-антитіло виявляється за допомогою ralis у майже всіх ссавців (мається на увазі наземкон'югата, що розщеплює субстрат, який характених тварин і людини), тест-система проста, надійризується появою темно-коричневого забарвленна в роботі, та проявляє високу чутли вість та ня, яке може реєструватись візуально по титру специфічність. дослідних сироваток або за допомогою спектроМетодом генної інженерії був отриманий анафотометра, шляхом вимірювання оптичної щільлог природного білка G – компонента клітинної ності субстрату. стінки штамів гемолітичних стрептококів, який здаОписані етапи одержання компонентів для потний зв'язуватися з Fc фрагментами імуноглобулістановки реакції ензимом мічених антитіл, особлинів класу G різних видів ссавців. Білок G являє во трихінельозного антигену за двома етапами, собою поліпептид з молекулярною вагою в біля досить трудомісткі і складні, крім того при викорис30кда. Геноінженерний (рекомбінантний) білок G танні фракціонованого антигену при постановці був модифікований на відсутність альбумінреакції зустрічаються помилково-позитивні реєднального домену. Одна молекула білка G здатзультати, реакція недостатньо специфічна, що на взаємодіяти із двома молекулами імуноглобулізначно знижує цінність реакції ензимом мічених ну класу G. Пероксидазний кон'югат на основі білантитіл при діагностиці трихінельозу. ка G отримали згідно стандартної методики Найбільш близьким аналогом є «Тест-система перійодатного окислення, по Вілсону-Накане, після на основі імуноферментного аналізу для прижитчого кон'югат використовують у вигляді інгредієнту тєвої ідентифікації антитіл до Trichinella Spiralis в тест-системи для виявлення антитіл ссавців. сироватці і плазмі крові тварини» [№56971UА, від Поставлена задача вирішується таким чином, 15.05.2003, кл. А61К39/00, ТОВ «ЛОГО МЕД»], у що у відомій тест-системі яка включає набір реацій тест-системі в м'язовій тканині тварини, яка гентів для імуноферментного аналізу, згідно з ковключає набір реагентів для імуноферментного рисною моделлю, в якості одного з інгредієнтів аналізу та концентрований трихінельозний антивикористовують пероксидазний кон'югат на основі 5 37758 6 білка G отриманий згідно стандартної методики з гемолізом та бактеріальним проростом для анаперійодатного окислення, по Вілсону-Нкане. лізу не придатні. Розроблена тест-система більш підходе до 2 Підготовка зразків міжтканинної рідини для практичної діяльності тому, що в разі виникнення досліджень. Шматочок до 20гр заморожуваного потреби діагностування окремого виду, чи декілька м'яса (м'якоті) кладуть у чашк у Петрі та розморовидів ссавців вона може оперативно використовужують при кімнатної температурі або в термостаті ватися в осередках інфекції або для поточного (37°С). Утворену сироватку (міжтканинну рідину) моніторингу за епізоотичною ситуацією. використовують для аналізу. Якщо немає можлиЗавдяки використанню імунопероксидазного вості провести аналіз в цей термін, зразки необкон'югату на основі білка G тест-система дозволяє хідно заморозити. Процес розморожування зразків без зміни комплектації проводити діагностику трисироваток повинен бути не більше 2 разів. хінельозу різних видів тварин використовуючи різні Проведення випробування. Готують розчин біологічні проби від цих тварин. №1 як описано вище. Виймають імуносорбент з До складу тест-системи входять слідуючи випакувального пакету та вносять в усі лунки по ди сировини (таблиця 1). 0,35см 3 розчину №1, витримують залитим 30-40 Кон'югат - специфічний рекомбінантний білок секунд і видаляють розчин з лунок за допомогою до імуноглобулінів тварин, що кон'югований із пепромивача або 8-канальної піпетки, після чого пороксидазою хрону". збавляються зайвої вологи, постукуючи планшеПозитивний контроль - сироватка крові тварин, том по фільтрувальному паперу. В кожну лунку які проімунізовані антигенами Trichinella spiralis та вносять по 0,09см 3 розчину №3 для розведення позитивно реагує у ІФА. Отримують в лабораторсироваток. В лунки планшету вносять по 0,01см 3 них умовах згідно з вимогами технологічних інзразків досліджуваних сироваток, залишивши віструкцій. льними 5 лунок першого ряду (лунки для контроНегативний контроль - сироватка крові тварин, лів). В дві лунки (А1, В1) вносять по 0,01см 3 позищо не містить антитіл до антигенів Trichinella spiтивного контролю (К+), а в три інші (D1- E1) - по ralis. Отримують в лабораторних умовах згідно з 0,01см 3 негативного контролю (К-). При внесенні вимогами технологічних інструкцій. контрольних та досліджуваних зразків необхідно Хромоген ТМБ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, обережно піпетувати суміш. Під час піпетування імпортований, фірми Clinical science product inc., відбувається зміна кольору розчину в лунках. Накат. №01016-1. кривають планшет клейкою плівкою або кришкою В залежності від комплектації система може та інкубують при температурі 37°С протягом 60 випускатись в трьох варіантах (таблиця 2). хвилин. По закінченні інкубації видаляють вміст Можливість практичного використання тестлунок за допомогою промивача або 8-канальної системи, що заявляється, ілюструється прикладом піпетки та промивають лунки чотири рази розчиконкретного виконання з використанням повної ном №1, після чого позбавляються зайвої вологи, сукупності ознак корисної моделі. постукуючи планшетом по фільтрувальному папеПриклад 1 ру. Проведення аналізу у розрахунку на одну поГотують розчин кон'югату. В лунки імуносорстановку ІФА - 96 лунок. Перед початком роботи бенту вносять по 0,1см 3 розчину кон'югату. Накрикомпоненти набору необхідно витримати при темвають планшет клейкою плівкою або кришкою та пературі (18-22)°С протягом 30 хвилин. Приготуваінкубують при 37°С протягом 20 хвилин. По закінти розчин для промивання планшета (розчин №1). ченні інкубації видаляють розчин кон'югату з лунок Вміст флакона концентрату розчина №1 інтенсивза допомогою промивача або 8-канальної піпетки но струшують і розводять у 350см 3 очищеної води та промивають лунки шість разів розчином №1, та перемішують. Якщо концентрат розчину криспісля чого позбавляються зайвої вологи, постукуталізований, його нагрівають перед застосуванням ючи планшетом по фільтрувальному паперу. Внопри (35-37)°С до повного розчинення кристалів. сять в лунки планшету по 0,1см 3 розчину хромогеРозчин можна зберігати при температурі (2-8)°С ну ТМБ. Накривають планшет клейкою плівкою не довше 5 діб. Далі готують розчин кон'югату. В або кришкою та інкубують при (18-22)°С в темному окремий флакон вносять 12см 3 розчину для промісці протягом 20 хвилин. Зупиняють кольорову мивання планшету, відбирають (0,3-0,4)см 3 розчиреакцію внесенням до всіх лунок по 0,05см 3 розну і вносять в ампулу з кон'югатом. Після повного чину №2 (стоп-реагенту). Не більше як через 1 розчинення вміст ампули переносять у флакон. хвилину після зупинення кольорової реакції визнаВміст флакона ретельно перемішують піпетуванчають оптичну густину (ОГ) в лунках в двохвильоням, не допускаючи піноутворення. Цю процедуру вому режимі (450нм відносно 620нм). повторюють тричі з метою повного вилучення Розраховують середнє значення оптичної гускон'югату з ампули. Розчин кон'югату готують безтини (ОГ) для лунок негативного контролю (ОГ К-) і посередньо перед використанням. для позитивного контролю (ОГ К+). Проведення Підготовка зразків до випробування аналізу вважають коректним, якщо ОГ К- не вище 1 Підготовка зразків сироваток крові тварин. 0,2 оптичної одиниці (ОО), а ОГ К + не нижче 0,6 Зразки сироваток, які містять осад необхідно освіОО. Якщо одне з трьох значень ОГ К- більше 0,2 тлювати центрифугуванням. Зразки сироваток ОО його відкидають та ОГ К- розраховують за резберігають (4±2)°С протягом трьох діб; якщо немає штою значень ОГ К-. Граничне значення ОГ (ГЗ). можливості провести аналіз в даний термін, зразки ГЗ розраховують, додаючи константну для кожної необхідно заморозити. Процес заморожування та серії наборів величину до значення ОГ К-. Значенвідтавання повинен бути не більше 2 разів. Зразки ня константної величини встановлює для кожної 7 37758 8 серії тест-систем виробник, і вказує його в настацифічність не нижче 95% при визначені методом нові по використанню тест-системи (Фіг.). ІФА з використанням стандартного набору позити"Сіра зона" - зона значень ОГ, яка простягавних та негативних сироваток. ється від ГЗ до значень менших ГЗ на 10%. Використовуючи названі тест-системи, досліРезультати аналізу вважаються негативними, джували сироватки крові (10 достеменно позитивякщо значення ОГ досліджуваного зразка менше них сироваток, 10 достеменно позитивних проб рівня ОГ "сірої зони". Результати аналізу вважаміжм'язової та 100 достеменно негативних зразків ються позитивними, якщо значення ОГ досліджусироваток). Усі зразки досліджували у чотирьох ваного зразка більше ГЗ. Зразки, які мають знаповторностях кожною тест-системою за описаною чення ОГ в межах "сірої зони", вважаються методикою. З 20 позитивних зразків наявність анневизначеними. Зразки, що дали позитивний або титіл проти Trichinella spiralis показали 20, що станевизначений результат, необхідно досліджувати новить 100% чутливості. З 100 негативних сироваповторно не менш як у двох лунках системи. Зразток у пропонованій тест-системі виявилися справді ки, позитивні в одній або більше лунках, слід вванегативними 95 (специфічність - 95%). В порівняжати позитивними. Зразки, негативні в дво х або льній тест-системі з 20 достеменно позитивних більше лунках, слід вважати негативними. В разі зразків 1 проба визначена як негативна. Чутлиотримання позитивного або невизначеного ревість становила 95%. З 100 негативних зразків зультату у випадку дослідження пулів сироваток виявилися справді негативними 95 зразка (специнеобхідно переставити кожний зразок сироватки фічність - 95%). окремо в розрахунку один зразок - одна лунка. Таким чином, пропонована тест-система заПриклад 2. Визначення чутливості та специфібезпечує виявлення антитіл проти антигенів Triчності пропонованої тест-системи. chinella spiralis у різних видів тварин використовуОсновними показниками якості тест-системи є ючи різні біологічні проби від цих тварин. Проста і показники чутливості та специфічності. Чутливість надійна в роботі, проявляє високу чутливість та тест-системи повинна бути не нижче 98%, а спеспецифічність. Таблиця 1 Назва показника Характеристика та норма Зовнішній вигляд, колір: - кон'югат імунофер- Світло-солом'яна опалесцентна рідина ментний - позитивний Світло-солом'яна трохи опалесцююча рідина контроль (К+) - негативний Світло-солом'яна трохи опалесцююча рідина контроль (К-) - хромоген ТМБ Прозора безбарвна рідина - концентрат розчину Безбарвна опалесцююча рідина, допускається розшарування та випадіння криста№1 лічного осаду, що розчинюється при температурі (35-37)°С протягом (15-20) хвилин. - розчин №2 Прозора безбарвна рідина - розчин №3 Фіолетова трохи опалесцююча рідина - імуносорбент Полістироловий суцільний або стриповий планшет або пластиковий гребінець з сорбованим на ньому антигенами Trichinella spiralis, не повинен мати тріщин та пошкоджень Концентрація водневих іонів (рН): - розчин №1 (7,3±0,1) при розчиненні 12см 3 розчину у 350мл очищеної води - розчин №3 (7,3±0,1) Номінальний об'єм, см 3 : - кон'югат Від 0,3 до 2,0 імуноферментний - позитивний контроль 0,1 або 0,3 (К+) - негативний контроль 0,1 або 0,3 (К-) - хромоген ТМБ 12 або 22 - концентрат розчину 5 або 12 №1 - розчин №2 6 або 12 - розчин №3 12 Чутливість та специфічність: - чутливість Не нижче 98%, при визначені методом імуноферментного аналізу з використанням стандартного набору позитивних сироваток - специфічність Не нижче 95%, при визначені методом імуноферментного аналізу з використанням стандартного набору негативних сироваток 9 37758 10 Таблиця 2 Варіант №1 1 .Імуносорбент - 2 суцільних планшета; 2. Кон'югат імуноферментний - 2 ампули від 0,1 до 2,0см 3; 3 Концентрат розчину №1 для промивання планшету - 2 флакони по 12см 3; 4 Розчин №2 (стоп-реагент) - 1 флакон -12см 3; 5 Розчин №3 для розведення сироваток - 2 флакони по 12см 3; 6 Хромоген ТМБ - 2 флакони по 12см 3, або 1 флакон-21см 3; 7 Позитивний контроль (К+) - 2 ампули по 0,10см 3; 8 Негативний контроль (К-) - 2 ампули по 0,10см 3; 9 Клейка плівка - 6 шт. Комп’ютерна в ерстка В. Мацело Варіант №2 1 Імуносорбент - 1 стриповий планшет (6 стрипів по 2 ряди кожен); 2. Кон'югат імуноферментний 3 ампули від 0,1 до 2,0см 3; 3 Концентрат розчину №1 для промивання планшету - 3 флакони по 5см 3; 4 Розчин №2 (стоп-реагент) - 1 флакон - 6см 3; 5 Розчин №3 для розведення сироваток - 1 флакон - 12см 3; 6 Хромоген ТМБ - 1 флакон 12см 3; 7 Позитивний контроль (К+) -1 ампула - 0,3см 3; 8 Негативний контроль (К-) -1 ампула - 0,3см 3; 9 Клейка плівка - 9 шт. Варіант №3 1. Імуносорбент - пластиковий гребінець - 3 шт. 2. Розчин №1 для розведення сироваток та кон'югату - 1 флакон 22см 3; 3. Кон'югат імуноферментний- 3 ампули по 0,05-0,1см 3; Хромоген ТМБ -1 флакон 7см 3; 4. Позитивний контроль (К+) - 1 ампула - 0,2см 3; 5. Негативний контроль (К-) - 1 ампула - 0,2см 3; 6. Планшет для проведення реакції багаторазового використання -1 шт. (за вимогою споживачів) Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601