Тест-система діагностична імуноферментна для визначення антитіл проти вірусу гепатиту с у сироватках або плазмі крові людини (“dia-hcv”)

Тест-система діагностична імуноферментна для визначення антитіл проти вірусу гепатиту С у сироватках або плазмі крові людини ("DIA-HCV"), в якій у складі імуносорбенту використовуються рекомбінантні поліпептиди, а кон'югатів - антивидові антитіла (антилюдина), мічені ферментом, яка відрізняється тим, що імуносорбент включає суміш рекомбінантних антигенів NS3, NS4-core, NS5, а кон'югат - моноклональні антитіла МКА25Д10 Винахід належить до біотехнологм, імунохімії та медицини і може бути використаний для проведення імунологічних досліджень, діагностичних аналізів інфікованості окремих людей та скринінгових досліджень груп населення на зараженість гепатитом С Відомий тест в Україні для виявлення зараженості гепатитом С базується на імуноферментній тест - системі "ІФА - HCV" [1], в складі якої на твердій фазі використовується злитий рекомбінантний білок, а у складі кон'югату антивидові антитіла, мічені пероксидазою В основу винаходу покладено завдання створити імуноферментну тест - систему на основі рекомбінантних антигенів NS4-core, NS3 та NS5, які мають імунодомшантні ПОСЛІДОВНОСТІ вірусу гепатиту С Антигени сорбують на поверхні полістиролових планшетів В складі кон'югатів використовуються моноклональні антитіла МКА 25Д10 проти імуноглобулінів людини, мічені ферментом Ферментативну реакцію визначають за допомогою субстратного розчину з хромогеном За одну постановку (2 години) можна проаналізувати 88 сироваток Приклад 1 Визначення антитіл проти антигенів вірусу гепатиту С у сироватці крові хворого К 1977 року народження Визначення проводять за відомою методикою (2) твердофазного імуноферментного аналізу Для цього 20мкл сироватки крові хворого вносять, у лунки планшету - імуносорбенту з фіксованими на ньому рекомбінантними пептидами та по 80мкл розчину для розведення сироваток, залишивши вільними 5 лунок першого ряду (контрольні лунки) В три лунки вносять по 20мкл негативного контролю (К~ - негативна на гепатит С сироватка крові людини), а в дві ІНШІ - по 20мкл позитивного контролю (К+ - позитивна на гепатит С сироватка крові людини) Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та шкубують при температурі 37°С протягом бОхв Після закінчення інкубації видаляють вміст лунок за допомогою промивача або 8-канальноі піпетки та промивають лунки чотири рази розчином для промивання планшетів В лунки планшету вносять по ЮОмкл розчину моноклонального кон'югату проти імуноглобулінів людини, міченого пероксидазою, та інкубують при 37°С у термостаті ЗОхв Після закінчення інкубації промивають лунки шість разів і вносять туди по ЮОмкл розчину проявника (субстратний розчин з хромогеном) та інкубують при 18 - 22°С у темряві 10 - 25хв Зупиняють кольорову реакцію, вносячи до всіх проб по 50мкл стоп - реагенту Не більше як через 1хв після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) со (О Ю 57639 ність антитіл проти вірусу гепатиту С, що складає в лунках у двохвильовому режимі за допомогою 100% чутливості 3 100 негативних сироваток виспектрофотометра Значення ОГ зразка прямо явилися справді негативними всі пропорційне КІЛЬКОСТІ антитіл у сироватці Значен100(специфічність - 100 %) у пропонованій тест ня КІЛЬКОСТІ антитіл проти вірусу гепатиту С у сисистемі В порівнюваній тест - системі з Роси з 20 роватціхворого, визначену при застосуванні нашої достеменно позитивних сироваток всі були позитест - системи, порівнювали зі значеннями, отритивними Чутливість становила 100% 1 негативна маними при використанні тест - системи виробнисироватка оказалась хибно позитивною Специфіцтва науково - дослідного об'єднання "Диагностичність порівняльної тест - системи становила 99% ческие системы» (Н Новгород, Росія) Досліджені сироваткихворого було ідентифікоТаким чином, пропонована тест - система завано як позитивні на наявність антитіл проти антибезпечує виявлення антитіл проти антигенів гепагенів вірусу гепатиту С титу С у сироватках людей Проста і надійна в роботі, проявляє високу чутливість та специфічність Приклад 2 Визначення чутливості та специфічності пропонованої тест - системи Використана література Використовуючи названі тест - системи, дослі1 Мартиненко Д Л Чумак Р М Іванська Н В та ш джували сироватки крові по 20 достеменно позиПатент 14747 A UA "Тест - система для виявлення тивних та 100 достеменно негативних сироваток антитіл проти вірусу гепатиту С (ІФА - HCV)" Усі сироватки досліджували у чотирьох повторнос2 А Т Михайлов, В Н Симирский "Методы иммунотях кожною тест - системою за описаною методихимического анализа в биологии развития" М кою Усі 20 позитивних сироваток показали наяв"Наука", 1981 Комп'ютерна верстка О Воробей Підписано до друку 05 07 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна