Тест-система діагностична імуноферментна для визначення протилептоспірозних антитіл у сироватках крові людини або тварин

Тест-система діагностична імуноферментна для визначення протилептоспірозних антитіл у сироватках крові людини або тварин, в складі якої як кон'югати використовують антивидові антитіла (анти ІдМ людини або анти-ВРХ, білок А, анти-кінь, анти-свиня), мічені ферментом, яка відрізняється тим, що містить імуносорбент з нанесеними антигенами очищених культур штамів лептоспор (493 Poland, Kabura, Perepehcyn, Pomona, Moskva V, Hond Utreht IV, M 20, Bratislava та Wijnberg) Винахід належить до імунохімії, медицини, ветеринарної медицини та може бути використаний для проведення імунологічних досліджень, діагностичних аналізів інфікованості людей або тварин на зараженість лептоспірозом Відома тест-система для виявлення антитіл (AT) проти лептоспірозу в сироватках крові базується на реакції мікроаглютинацм (РМА) [1] При проведенні РМА за антигени правлять живі культури лептоспір різних серологічних груп у ВІЦІ 5 15 днів без ознак аглютинації і лізису, при дослідженні культуральної рідини під мікроскопом в одному полі зору має бути нараховано 70 - 100 мікробних клітин при збільшеннях 20 х 10 або 40 х 10 Сироватку досліджують в чотирьох розведеннях- 1 50, 1 100, 1 500 та 1 2500 Реакцію ставлять в аглютинацій них пластинах Кожне розведення сироватки розливають по ЮОмкл в окремий ряд, що складається з 7 - 15 лунок в залежності від КІЛЬКОСТІ культур лептоспір (що правлять за антигени), які використовуються в реакції Кожну культуру-антиген вносять по ЮОмкл у 4 лунки з різними розведеннями сироватки Після додання антигенів пластини струшують и витримують у термостаті при температурі 30°С протягом години Контролем є суміш культури лептоспір з фізіологічним розчином (0,85% розчин хлористого натрію) Лептоспори в контролі мають бути рухливі, без ознак лізису та аглютинації Реакцію враховують шляхом мікроскопи крапель з кожної лунки в темному полі мікроскопа Цей метод небезпечний тим, що за антиген правлять живі культури лептоспор, крім того, метод малоефективний за один робочий день можна проаналізувати за допомогою мікроскопа лише тільки 20 - ЗО сироваток В основу винаходу покладено завдання створити імуноферментну тест-систему на основі антигенів, виділених з очищених культур штамів лептоспор (493 Poland, Kabura, Perepehcyn, Pomona, Moskva V, Hond Utreht IV, M 20, Bratislava та Wijnberg), антигени засорбовують на поверхні полістиролових планшетів В складі кон'югатів використовуються антивидові антитіла (анти ІдМ людини або анти-ВРХ, анти-кінь) чи білок А, мічені ферментом Ферментативну реакцію визначають за допомогою субстратного розчину з хромогеном За одну постановку можна проаналізувати 88 сироваток за 2 години Приклад 1 Визначення антитіл проти антигенів лептоспори в сироватці крові людини В кожну лунку стрипів планшету вносять по 80мкл розчину для розведення сироваток і по 20мкл зразків досліджуваних сироваток, залишив (О ю 00 48561 ши вільними 5 лунок першого ряду (контрольні лунки) В три лунки вносять по 20мкл негативного контролю (КГ - негативна на лептоспіроз сироватка крові людини), а в дві ІНШІ - по 20мкл позитивного + контролю (К - позитивна лептоспірозна сироватка крові людини) Накривають стрипи клейкою плівкою або кришкою та шкубують при температурі 37°С протягом бОхв Після закінчення інкубації видаляють вміст лунок за допомогою промивача або 8-канальноі піпетки та промивають лунки чотири рази розчином для промивання планшетів В лунки стрипів вносять по ЮОмкл розчину антивидового кон'югату - анти lgM-людини, міченого пероксидазою, та шкубують при 37°С у термостаті 45хв Після закінчення інкубації промивають лунки шість разів і вносять туди по ЮОмкл розчину проявника (субстратний розчин з хромогеном) та шкубують при 18 - 22°С у темряві 10 - 25хв Зупиняють кольорову реакцію, вносячи до всіх проб по 50мкл стоп-реагенту Не більше як через 1хв після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі за допомогою спектрофотометра Значення ОГ зразка прямо пропорційне КІЛЬКОСТІ антитіл у сироватці КІЛЬКІСТЬ антитіл в сироватці, визначену при застосуванні нашої тест-системи, порівнювали з даними, отриманими при застосуванні реакції мікроаглютинацм Результати проведених досліджень доводять 100%-ну чутливість пропонованої тест-системи Приклад 2 Визначення антитіл проти антигенів лептоспіри в сироватці крові ВРХ проводили аналогічно прикладу 1, але в якості антивидового кон'югату застосовували анти-ВРХ кон'югат, мічений пероксидазою, за позитивний контроль (К+) служила позитивна лептоспірозна сироватка крові ВРХ, за негативний контроль (КГ) правила негативна на лептоспіроз сироватка крові ВРХ Приклад 3 Визначення антитіл проти антигенів лептоспіри в сироватці крові свині проводили ана логічно прикладу 1, але в якості антивидового кон'югату застосовували кон'югат білку А з перок+ сидазою, за позитивний контроль (К ) служила позитивна лептоспірозна сироватка крові свині, за негативний контроль (КГ) правила негативна на лептоспіроз сироватка крові свині Приклад 4 Визначення антитіл проти антигенів лептоспіри в сироватках крові коней проводили аналогічно прикладу 1, але в якості антивидового кон'югату застосовували антитіла проти імуноглобулшів коня, мічені пероксидазою, за позитивний + контроль (К ) брали позитивну лептоспірозну сироватку крові коня, а за негативний контроль (КГ) правила негативна лептоспірозна сироватка крові коня Приклад 5 Визначення чутливості та специфічності пропонованої тест-системи Використовуючи названі тест-системи, досліджували сироватки крові по (20 достеменно позитивних та 50 достеменно негативних сироваток) Усі сироватки досліджували у чотирьох повторностях кожною тест-системою за описаною методикою Усі 20 позитивних сироваток показали наявність антитіл проти лептоспіри, що становить 100% чутливості 50 негативних сироваток виявилися справді негативними (специфічність -100%) у пропонованій тест-системі В порівнюваній реакції мікроаглютинацм з 20 достеменно позитивних сироваток 4 були негативними (титр < 1 50) Чутливість РМА становила 80% Таким чином, пропонована тест-система забезпечує виявлення антитіл проти антигенів лептоспіри у сироватках людей, ВРХ, свиней та коней Проста і надійна в роботі, проявляє високу чутливість та специфічність Використана литература 1 Kelly P W Leptospirosis In, Infectious disease in medicine and surgery Gorbach S, Bartlett J, Balcklow N, (eds) Philadelphia, Saunders, 1991, p 1295 1302 2 A T Михайлов, В Н Симирский "Методы иммунохимического анализа в биологии развития" М "Наука", 1981 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71