Тест-система на основі імуноферментного аналізу для прижиттєвої ідентифікації антитіл до trichinella spiralis в сироватці і плазмі крові тварини (іфа-трихінела скрин тест ав)

Винахід відноситься до ветеринарної медицини, а саме до виявлення антитіл до Trichinella spiralis в сироватці та плазмі крові тварини. Личинка Trichinella spiralis є небезпечним збудником хвороби теплокровних тварин ї людей. Вона завдає великої шкоди свиноробству і приводить до значних збитків у сільському господарстві. На сьогодні в Україні склалась тривожна ситуація відносно трихінельозу. Широке розповсюдження хвороби серед свиней і неодноразові випадки зараження людей через вживання свинини свідчать про недостатній контроль за поширенням вогнищ інфекції і недостатній рівень тестування інфікованих тварин. Діагностика трихінельозу на містах відбувається методом компресійної трихінелоскопії, що є дуже трудоємким, малоефективним відносно чутливості методом і не задовольняє сучасним потребам у діагностиці захворювання. Найбільш чутливим і достатньо специфічним сучасним методом діагностики трихінельозу у світі є метод імуноферментного аналізу, який полягає в тому, що у зразках сироватки тварин і людей тестують вміст специфічних до збудника антитіл. Звичайно тестування цим методом дає позитивний сигнал на 16-25 день після інфікування тварини, в той час, як стандартний метод трихінелоскопії в такий термін дає дуже низький відсоток виявлення інфекції. Порівняно з методом трихінелоскопії імуноферментний метод має також незаперечну перевагу при скринінгових дослідженнях. Найближчим аналогом винаходу є спосіб виявлення нематод Trichmella spiralis, який полягає в тому, що в лунки мікропланшета для імунологічних досліджень, які є інертними носіями антигену і антитіл, послідовно вносять розчинений антиген, досліджувану сироватку крові, кон'югат і субстрат. Кон'югат це розчин антивидових антитіл мічених ферментом. В якості антигену використовують трихінельозний антиген, який одержують з личинок трихінел. Антиген одержують в 2 етапи, спочатку готується цільний екстракт личинок трихінел, потім він фракціонується методом гель-хроматографії на сефадексі G-200. Створений в процесі постановки реакції комплекс антиген-антитіло виявляється за допомогою кон'югата, що розщеплює субстрат, який характеризується появою темно-коричневого забарвлення, яке може реєструватись візуально по титру дослідних сироваток або за допомогою спектрофотометра, шляхом вимірювання оптичної густини субстрату (1). Недоліком цієї тест-системи її трудомісткість і складність. До того ж використання фракціонованого антигену може давати помилкові результати. В основу винаходу поставлена задача розробити тест-систему "ІФА-Трихінела скрін тестАВ" на основі імуноферментного аналізу для прижиттєвої ідентифікації антитіл до Trichinella spiralis в сироватці і плазмі крові тварини шляхом застосуванням набору реагентів, що дозволяло би спростити процес ідентифікації личинок Trichinella spiralis та підвищити його надійність. Виходячи з цих міркувань розроблено на основі імуноферментного методу тест-систему "ІФА-Трихінела скрин тест AB", яка задовольняє сучасним вимогам діагностики тріхинельозу відносно чутливості і специфічності і може бути використана для скринінгових обстежень. Поставлена задача вирішується у тест-системі на основі імуноферментного аналізу для прижиттєвої ідентифікації личинкової стадії Trichinella spiralis в м'язовій тканині тварини, яка включає набір реагентів для імуноферментного аналізу та концентрований трихінельозний антиген, відповідно до винаходу; до лунок полістиролових планшетів де знаходиться адсорбований антиген Trichinella spiralis вносять досліджувані зразки сироваток або плазми крові при цьому специфічні до антигену антитіла зв'язуються з антигеном на твердій фазі, утворюючи комплекси антиген-антитіло, після відмивання антитіл, що не зв'язались, в лунки планшетів вносять імуноферментний кон'юга'нт, позначений пероксидазою, який зв'язується з комплексами антиген-антитіло, а після інкубації та відмивання непов'язаного кон’югату, в лунки додають субстрат пероксидази перекис водню та хромоген - ортофенілендіамін, пероксидазну реакцію зупиняють, додаючи 2М розчин сірчаної кислоти, і вимірюють оптичну густину суміші в лунках, яка при довжині хвилі світла 492 нм та 620 нм пропорційна концентрації специфічних антитіл у досліджуваних зразках. Для виключення хибних результатів зразки, що досліджуються, необхідно готувати і зберігати в умовах, які запобігають бактеріальному проростанню. Треба освітлювати зразки, які містять агрегати та осад за допомогою центрифугування. Зібрані зразки зберігають при температурі 4-8°С на протязі 72 годин. Якщо немає можливості провести аналіз в цей термін, зразки необхідно заморозити (до -20°С). Слід запобігати размороження зразків більше двох разів. Кожний зразок сироватки або буферний розчин відбирають окремим чистим наконечником. Склад набору. № 1 2 3 4 5 6 7 Назва компоненту Кількість Полістиролові планшети з 2шт. адсорбованим антигеном Концентрат розчину для 1 фл. промивання планшетів 20мл Розчин для робочого розведення 2 фл. сироваток 20мл 1 фл. Розчин для розведення кон'югату 20мл Розчин для приготування 1 фл. хромогену 20мл Кон’югат мічений пероксидазою 0,02мл проти імуноглобулінів класу 0 свиней 2 Хромоген (ОФД) таблетки 8 9 Позитивна контрольна сироватка Негативна контрольна сироватка 10 Стоп-реагент 2М H2SO4 11 Клейка плівка Планшет для попереднього розведення сироваток 12 0,05мл 0,05мл 1 фл. 10мл 2шт. 2шт. Проведення аналізу (у розрахунку на 1 планшет). Перед проведенням аналізу тест-систему витримують при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Готують розчин для промивання планшетів. Для цього 10мл концентрату розчину для промивання планшетів розводять у 290мл дистильованої води. Якщо концентрат розчину кристалізований, його прогрівають перед застосуванням при 35-37°С до повного розчинення кристалів. Вносять у всі лунки планшету для попереднього розведення по 95мкл розчину для розведення сироваток. Вносять в лунки планшету аналогічно по 5мкл досліджуваних сироваток, залишивши вільними від зразків вісім контрольних лунок. Вносять в три з восьми контрольних лунок планшету по 5мкл позитивного контролю. Вносять в три інші лунки по 5мкл негативного контролю. Залишають без зразків дві контрольні лунки (контроль кон’югату). Вносять в усі лунки планшету з імуносорбентом по 90мкл розчину для розведення сироваток. Переносять з планшету для попереднього розведення сироваток по 10мкл розведення у планшет з імуносорбентом. Закривають планшет клейкою плівкою та інкубують його при 37°С 60 хвилин. Промивають планшет розчином для промивання планшетів 4 рази, після цього позбавляються вологи постукуючи планшетом по фільтрувальному папері. Готують розчин кон'югату. Для цього вміст ампули кон'югату вносять у 10мл розчину для розведення кон'югату, ретельно піпетують недопускаючи піноутворення. Вносять в усі лунки планшету по 100мкл розчину кон'югату та інкубують його при 37°С 30хвилин. Промивають планшет розчином для промивання планшетів 6 разів, після цього позбавляються вологи постукуючи планшетом по фільтрувальному папері. Готують розчин проявника: для цього одну таблетку або вміст порошку однієї капсули вносять у 10мл розчину для приготування хромогену, ретельно струшують 2-4 хвилини до повного розчинення хромогену. Вносять по 100мкл розчину проявника в усі лунки планшету та інкубують в темному місці 30 хвилин. Зупиняють реакцію додаванням в кожну лунку 50мкл стоп-реагенту і визначають оптичну густину у двохвильовому режимі (492нм та 620нм) Облік результатів аналізу. Розраховують середнє значення оптичної густини для лунок позитивного і негативного контролів. Проведення аналізу вважають коректним, якщо середнє значення оптичної густини негативного контролю не вище ОД оптичної одиниці, а середнє значення позитивного контролю не нижче 0,6. Якщо одне з трьох значень негативного контролю більше 0,1 оптичної одиниці, його відкидають і середнє значення розраховують за значеннями оптичної густини решти лунок. Граничне значення розраховують, додаючи сталу для даної серії наборів величину оптичної густини негативного-контролю. "Сіра зона" - зона значень оптичної густини досліджуваних зразків, яка простягається від граничної зони до значень оптичної густини меньших граничного значення на 10%. Результати тестування вважають позитивними, якщо оптична густина досліджуваного зразка більша ніж граничне значення. Результати тестування вважають негативними, якщо оптична густина досліджуваного зразка менша рівня "сірої зони". Форма випуску набору. Діагностичний імуноферментний набір " ІФА-Трихінела скрін тест AB " складається з двох комплектів реагентів. Набір розраховано на проведення 176 аналізів. Джерела інформації: 1. Бессонов A.C. Диагностика трихинеллеза, Вильнюс, «Митне», 1975, -с.383.