Спосіб оцінки гемосидерозу печінки у хворих на хронічну патологію печінки

1. Спосіб оцінки гемосидерозу печінки у хворих на хронічну патологію печінки, що включає оцінку морфометричних показників шляхом морфологічного дослідження біоптату печінки, який відрізняє ться тим, що як морфометричний показник визначають питому площу гемосидерину в перипортальній зоні печінкових часточок. 2. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що при перевищенні питомої площі гемосидерину в перипортальній зоні печінкових часточок - 38,3%, встановлюють виражений гемосидероз печінки. Корисна модель відноситься до галузі медицини, конкретно до гепатології, а саме до морфометричних методів верифікації гемосидерозу печінки (ГСП) у хворих на хронічні гепатити, зокрема на хронічній гепатит С (ХГС). Щорічне зростання захворюваності на ХГС, значна кількість ускладнень в цій групі хворих розвиток цирозу печінки, гепатоцелюлярного раку [Возианова Ж.И. Вирусные гепатиты. II. Осложнения, исходы, диагностика и принципы лечения // Лікування и діагностика. - 1997. - №2. - С.39-47], обумовлює необхідність визначення значущих патогенетичних ланок, які сприяють прогресуванню ХГС [Громашевська Л.Л. Диагностика хронічного гепатиту С: біо хімічні дослідження // Лаб. діагностика. - 2003. - №4. - С.9-11], і потребує розробки вірогідних морфологічних тестів для оцінки порушень в тканині печінки [Малый В.П., Звягинцева Т.Д., Ти товский СП. HCV - инфекция (острая и хроническая). Клинико-патогенетические и терапевтические аспекты. - Киев. - 2005. - 291с]. В раніш проведених дослідженнях було визначено, що одним з можливих факторів, який сприяє прогресуванню фіброзу у хворих на ХГС є накопичення заліза в паренхімі печінки [Casaril M., Stanzial A.M., Tognella P. et al. Role of iron load on fibrogenesis in chronic hepatitis С // Hepatogastroenterology.-2000 - Jan-Feb;47(31). P.220-225]. Фіброгенез при впливі іонів Fe2+ обумовлений спроможністю іонів заліза: каталізувати окислення ліпідів, білків з утворенням вільних радикалів, ушкоджувати мембрани і генетичний апарат гепатоцитів вільними радикалами, ініційовувати зірчасті клітини і збільшувати їх вміст в тканині печінки, активувати клітини ІТО - головне джерело утворення позаклітинного матрикса в печінці [Pietrangelo A. Iron, oxidative stress and liver fibrogenesis // J. Hepatol. - 1998. - Vol. 28. - P.8-13], і як наслідок індукувати створення колагену в місцях відкладення заліза [Маммаев С.Н., Лукина Е.А., Павлов Ч.С. и др. Показатели метаболизма железа и антиоксидантная активность сыворотки крови у больных хроническим вирусным гепатитом С // Российский журнал гепатологии, гастроэнтерологии и колоп-роктологии. - 2003. - №2. - С.337]. Таким чином, навіть помірне збільшення залізного перевантаження стимулює печінковий фіброгенез і асоціюється з вірусним ушкодженням печінки [Walker E.M. Jr., Walker S.M. Effects of iron overload on the immune system // Ann. Clin. Lab. Sci. (19) UA (11) 38131 (13) U (21) u200808795 (22) 03.07.2008 (24) 25.12.2008 (46) 25.12.2008, Бюл.№ 24, 2008 р. (72) ПІНСЬКИЙ ЛЕОНІД ЛЕОНІДОВИЧ, UA, ГРОМАШЕВСЬКА ЛЮБОВ ЛЕОНТІЇВНА, U A, ФРОЛОВ ВАЛЕРІЙ МИТРОФАНОВИЧ, U A, РЕШЕТНІКОВА ОЛЬГА СЕРГІЇВНА, U A, ЗІНЧЕНКО ОЛЬГА ВОЛОДИМИРІВНА, U A, ОВЧАРЕНКО ВОЛОДИ МИР ВІКТОРОВИЧ, U A, ОВЧАРЕНКО ТЕТЯНА МИКОЛАЇВНА, U A, КАПРАНОВА ТЕТЯН А СЕРГІЇВН А, U A (73) ЛУГАНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ, UA, ДЕРЖАВН А УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ЕПІДЕМІОЛОГІЇ ТА ІНФЕКЦІЙНИХ ХВО 3 38131 - 2000.- Oct; 30(4). P.354-365]. При синдромі перевантаження залізом (СПЗ) у хворих на ХГС в печінці відбувається накопичення гемосидерину (ГСН), який утворюється в результаті деградації феритину, пересиченого залізом [Смирнов О.А. Частота и морфологическая характеристика гемосидероза печени // Российский медицинский журнал. - 2002. - №6. - С.11-14]. Важливим у вивченні цієї проблеми є і те, що у хворих на ХГС із СПЗ суттєво зростає резистентність до інтерферонотерапії [Мороз Л.В. Хронічні вірусні гепатити В та С. Поширеність, клініко-морфологічні паралелі // Автореф. дис... д. мед. н.- Київ, 2002. 38с.), а зменшення навантаження сироватки і печінки залізом значно покращує результати лікування (Возіанова Ж.І., Корчинський М.Ч. Проблеми лікування інтерфероном хворих на хронічні вірусні гепатити // Сучасні інфекції. - 2001. - №2. - С 52-65]. В аналозі [Alustiza J.M., Artetxe J., Castiella A. et al. MR quantification of hepatic iron concentration // Radiology. - 2004 Feb; 230(2).- P.479-484] за результатами обстеження 112 пацієнтів був запропонований спосіб верифікації ГСП за допомогою порівняльного магнітно-резонансного дослідження сигнальної інтенсивності печінки та параспінальних м'язів. Проте, до недоліків запропонованого способу слід віднести його низьку специфічність при концентрації заліза в тканині печінки меньш ніж 85мкмоль/г. При помірному відкладенні ГСН в тканині печінки має місце низька чутливість щодо визначення ГСП. Результати запропонованого способу залежать від наявності у хворих патології параспинальних м'язів, спосіб малочутливий при початкових стадіях ГСП та висококоштовний. В аналозі [Lefkowitch J.H., Yee H.T., Sweeting J. et al. Iron-rich foci in chronic viral hepatitis // Hum. Pathol. - 1998 Feb; 29(2). - P.116-118] запропонована оцінка ГСП за наявністю фокусів відкладень ГСН в тканині печінки. Проте, до недоліків цього методу слід віднести: відсутність кількісних та напівкількісних критеріїв вираженості ГСП, відстуність аналізу локалізації фокусів ГСН в різних ланках печінкових часточок, низьку специфічність запропонованого способу. В способі прототипі [Scheuer P.J., Williams R., Muir A.R. Hepatic pathology in relatives of patients with haemachromatosis // J. Path. Bact. - 1962. V.84. - №1. - P.53-54] запропонована оцінка вираженості ГСП за відсотком гепатоцитів, які містять ГСН, де 1 ступінь - коли ГСН має місце в менш ніж в 25% гепатоцитів, 2 ступінь - в 25-50%, 3 ступінь в 50-75% гепатоцитів, крім центролобулярних, 4 ступінь - ГСН в більшості клітин всіх зон часточок. Основним недоліком прототипу є те, що цей метод є напівкількісним та не враховує конкретну зону печінкових часточок, де відбувається відкладення ГСН (центролобулярну, портальну, перипортальну). У зв'язку з ви щевикладеним, в основу винаходу покладено задачу підвищення точності морфометричної оцінки вираженості ГСП у хворих на хронічну патологію печінки, шляхом встановлення питомої площі ГСН в різних зонах печінкових часточок та оцінка впливу морфологічних ознак на 4 прогресування фіброзу печінки, що дозволить суттєво підвищити ін формативність морфологічного обстеження хворих на хронічну патологію печінки та визначати найбільш інформативні морфометричні ознаки. Поставлена задача вирішується в способі діагностики ГСП у хворих на хронічну патологію печінки за допомогою додаткового включення до морфометричного обстеження біоптатів печінки показника - площі ГСН в перипортальній зоні печінкових часточок. Підставою для цієї пропозиції була вперше встановлена закономірність, яка полягає в тому, що прогресування фіброзу при хронічній патології печінки, в найбільшій мірі залежить від питомої площі ГСН в перипортальній зоні часточок та найбільший вплив ГСП на фіброгенез має при перевищенні цього показника - 38,3 %. Під час численних досліджень встановлено, що вказаний спосіб є вірогідним методом морфометричної оцінки ГСП у хворих на хронічну патологію печінки, незалежно від віку, статі хворого, індексу маси тіла та відзначається тільки наявністю ГСН в тканині печінки. Спосіб здійснюється таким чином: у хворих на хронічну патологію печінки шляхом морфологічного дослідження біоптату печінки визначають питому площу ГСН периферійної зони печінкових часточок, та при перевищенні цього показника - 38,3 %, встановлюють виражений гемосидероз печінки. При розробці заявленого способу для його клінічного і патогенетичного обґрунтування було обстежено 44 хворих на ХГС у віці від 19 до 66 років, з яких 34 особи чоловічої статі і 10 - жіночої. Діагноз ХГС встановлений на підставі комплексу клініко-біохімічних показників, підтверджувався визначенням антитіл-анти-HCV і полімеразною ланцюговою реакцією - HCV-RNA, проведенням УЗД органів черевної порожнини з визначенням розмірів печінки, її ультразвукової щільності, стану судин, жовчовивідних шляхів. Для виключення вірусних гепатитів іншої етіології проводилось дослідження HbsAg, HbeAg, анти-HbeAg, анти-Hbclg M, анти-Нbс сумарні, анти-Hbs, анти-HDV. Біопсія печінки проводилась під контролем УЗД під місцевою анестезією. Величина фрагменту печінкової тканини, яка була отримана при біопсії, була більш 10 мм. Для фарбування гістологічних зразків нами були використані методи фарбування: гематоксиліном і еозином, пікрофуксином за Ван Гізон, визначення ГСП [Perls M. Nachweis von Eisenoxyd in gewissen Pigmentation // Virchows Archive fuor pathologische. Anatomice and Physiologie and fur Klinisch Medizine. - 1867. - N 39. - P.42-47]. Стадія фіброзу визначалась за METAVIR [The French METAVIR Cooperative Study Group. Intraobserver and interobserver variations in liver biopsy interpretation in patients with chronic hepatitis С // Hepatology. - 1994. - N 20. - P.15-20], індекс гістологічної активності за Knodell R.G. et al. [Knodell R.G., Ishak K.G., Black W.C. et al. Formulation and application of a numeral scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis // Hepatology.- 1981.-№1.-P.431-435]. 5 38131 Група хворих на ХГС була розподілена на 2 групи за ознаками активності процесу. До групи із малою активністю ХГС (ІГА за Knodell 1-8 балів) увійшло 27 (61,4%) чоловік, з помірною активністю (ІГА за Knodell 9-15 балів) - 17 (38,6%). Серед 44 обстежених до групи із стадією фіброзу F0 - 4 хворих (9,1 %), F1 - 12 (27,3%), F2 - 11 (25,0%), F3 - 10 (22,7%), F4 - 7 (15,9%) хворих на ХГС. Нами також для оцінки вираженості гемосидерозу у хворих на ХГС був використаний спеціалізованийпакет прикладних програм "Morpholog" [Овчаренко В.В., Маврич В.В., 2003; свідоцтво про реєстрацію авторського права № 9604], який був створений на кафедрі нормальної анатомії людини ЛДМУ (завідувач-професор В.Г.Ковешніков). Нами було проведено мікроморфометричне дослідження тканини печінки на комп'ютерному морфометричному комплексі, до складу якого входили: мікроскоп Olympus BX-41, цифровий фотоапарат Olympus C5050Z з п'ятимегапіксельною матрицею, що з'єднаний з мікроскопом системою відеоадаптерів цієї ж фірми. До складу комплексу також входить персональний комп'ютер Athlon XP 2200+, DDR RAM 512 mB, HDD 128 Gb, video: GeForce FX5200 128Mb, що обладнаний платою відеозахвату, з'єднаний з цифровою камерою за допомогою USB інтерфейсу, а також за допомогою відеокабелю. Цей комплекс дозволяє переглядати на екрані монітора зображення гістологічного препарату в реальному масштабі часу, вибирати необхідну ділянку для фотографування, за допомогою програмних засобів керувати режимом роботи цифрового фотоапарата (виставлення зумера, корекції кольорової гами, зміна фокусу, розмір та компресія зображення тощо) отримувати цифрові зображення гістологічних препаратів та зберігати їх на жорсткому диску комп'ютера для подальшого аналізу. Мікрофотографії отримували в кількох режимах збільшення: при об'єктиві 4х та 10х для дослідження макро-мікробудови та з об'єктиву 40х для дослідження мікробудови при постійному оптичному зумері фотоапарата рівному 162. Отримані в результаті роботи програми дані морфометричного дослідження експортувалися в програму Excel для подальшої статистичної обробки. В кожному отриманому зображенні гістологічного препарату визначались такі параметри: питома площа відкладення гемосидерину (ППГ) в гістологічних зрізах печінки хворих на ХГС, кількість гепатоцитів в обстеженій ланці часточок, середня площа гемосидерину на 1 гепатоцит (СПГ). ППГ була отримана діленням площі відкладень ГСН в досліджуваній ланці тканини печінки на загальну площу цієї ланки. СПГ була обчислена шляхом діленням площі ГСН на кількість гепатоцитів в цієї ж ланці печінки. Всі морфометричні дослідження проводились в 3 зонах часточок: центролобулярній, периферійній і портальній. Статистичну обробку отриманих матеріалів проводили на комп'ютері Athlon XP 2500+ за допомогою програми Statistica 6. В загальній групі хворих на ХГС частота ГСП морфологічно була верифікована у 24 з 44 хворих (52,3%). Розподіл вираженості ГСП був таким: 1 ступінь (за Scheuer P.J.) - 3 пацієнта (12,5%), 2 ступінь - 5 (20,8%), 3 ступінь - 10 (41,7%), 4 ступінь 6 - 6 (25%). Гемосидероз 1-2 ступеней мав характерну морфологічну картину, коли гепатоцити переважно перипортальної зони часточок мали поодинокі зернини заліза дрібнокрапельної структури. При 3-4 ступені гемосидерозу спостерігалось зростання кількості і розмірів гранул ГСН в периферійній зоні, поява і зростання вмісту гранул ГСН в лобулярній зоні часточок. За класифікацією ГСП за локалізацією депонентів заліза - паренхіматозний тип спостерігався у 19 хворих (79,2%). Крім паренхіматозного типу розподілу ГСН нами був визначений змішаний тип, коли із паренхіматозним поєднується ретикулоендотеліальний тип, який супроводжувався відкладенням ГСН в синусоїдальних клітинах і макрофагах портальних трактів - 5 спостережень (20,8%). При аналізі частоти ГСП у хворих на ХГС із різною гістологічною активністю нами встановлено, що з 27 хворих із мінімальною активністю (ІГА - 1-8 балів за Knodell) - 3 (11,1%) пацієнта мали 1 ступінь ГСП, 3 (11,1%) - другу ступінь, 5 (18,5%) - третю, 1 (3,7%) - четверту ступінь ГСП. В групі з помірною гістологічною активністю (ІГА - 9-15 балів за Knodell) розподіл інтенсивності ГСП був таким: 1 ступінь ГСП виявлено не було, 2 - спостерігалась у 2 хворих (11,8 %), 3 - у 5 пацієнтів (29,4%) і 4 - у 5 хворих на ХГС (29,4%). Таким чином, значне відкладення ГСН в тканині печінки (3-4 ступінь ГСП за Scheuer P.J.) спостерігалась лише в 22, 2% хворих із мінімальною активністю гепатиту і в 58,8 % випадків при помірній гістологічній активності гепатиту (р