Спосіб оцінки стеатозу печінки у хворих на хронічну патологію печінки

1. Спосіб оцінки стеатозу печінки у хворих на хронічну патологію печінки, що включає оцінку морфометричних показників шляхом морфологічного дослідження біоптату печінки, який відрізняється тим, що як морфометричний показник визначають питому площу ліпідних гранул перипортальної зони печінкових часточок. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що при перевищенні питомої площі ліпідних гранул перипортальної зони печінкових часточок - 24,7%, встановлюють виражений стеатоз печінки. (19) (21) u200807721 (22) 06.06.2008 (24) 25.11.2008 (46) 25.11.2008, Бюл.№ 22, 2008 р. (72) ПІНСЬКИЙ ЛЕОНІД ЛЕОНІДОВИЧ, UA, ГРОМАШЕВСЬКА ЛЮБОВ ЛЕОНТІЇВНА, U A, ФРОЛОВ ВАЛЕРІЙ МИТРОФАНОВИЧ, U A, РЕШЕТНІКОВА ОЛЬГА СЕРГІЇВНА, U A, ЗІНЧЕНКО ОЛЬГА ВОЛОДИМИРІВНА, U A, ОВЧАРЕНКО ВОЛОДИ МИР ВІКТОРОВИЧ, U A, ОВЧАРЕНКО ТЕТЯНА МИКОЛАЇВНА, U A, СУЩЕНКО ЮРІЙ АНДРІЙОВИЧ, U A (73) ЛУГАНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ, UA, ДЕРЖАВН А УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ЕПІДЕМІОЛОГІЇ ТА ІНФЕКЦІЙНИХ ХВО 3 37349 lular steatosis //Am. J. Gastroenterol. - 2005. Mar;100(3). -P.711-715], проте внаслідок того, що визначення гранул ліпідів в тканині печінки не входить до стандартних морфологічних методів обстеження хворих на хронічні гепатити, адекватних методів оцінки вираженості стеатозу, як профіброгенного фактору розроблено не було. Актуальною є визначення таких морфометричних ознак стеатозу печінки, які в найбільшій мірі впливають на прогресування хронічного гепатиту і розвиток фіброзу. В аналозі [Hepburn M.J., Vos J.A., Fillman E.P. et al. The accuracy of the report of hepatic steatosis on ultrasonography in patients infected with hepatitis С in a clinical setting: a retrospective observational study //BMC Gastroenterol. -2005.- Apr 13;5(1). -P. 14] при аналізі результатів ультразвукового дослідження (УЗД) 164 пацієнтів із ХГС було запропоновано використання УЗД для визначення вираженості стеатозу в тканині печінки. Проте при використанні запропонованого аналогу має місце низька специфічність щодо визначення СП, а в більшості випадків встановлені УЗД зміни відповідають зростанню гістологічної активності та фіброзу печінки. За даними [Younossi Z.M., McCullough A.J., Ong J.P. et al. Obesity and non-alcoholic fatty liver disease in chronic hepatitis С //J. Clin. Gastroenterol. -2004.- Sep;38(8). -P.705–709] ожиріння є надійним предиктором, який супроводжує СП у хворих на хронічну патологію печінки. Проте цей метод має велику специфічність лише щодо визначення СП у хворих із великим індексом маси тіла та метаболічним синдромом, але низьку чутливість в групі пацієнтів із нормальною або зниженою масою тіла. В аналозі [Liu C.J., Jeng Y.M., Chen P.J. et al. Influence of metabolic syndrome, viral genotype and antiviral therapy on superimposed fatty liver disease in chronic hepatitis С //Antivir. Ther.- 2005.- 10(3).P.405-415] встановлена залежність відкладень жирових крапель в тканині печінки від рівню гіпертригліцеридемії. В роботі [Fujie Η., Yotsuyanagi Η., Moriya Κ. et al., Steatosis and intrahepatic hepatitis С virus in chronic hepatitis //J. Med. Virol. -1999.-Oct;59(2). P.141-145] встановлена залежність відкладень жирових крапель в печінкових часто точках у хворих на ХГС від наявності в тканині печінки HCV позитивного капсидного білка. Проте при верифікації стеатозу в тканині печінки додаткове дослідження HCV позитивного капсидного білка має високу специфічність, але малу чутливість, тому що, крім вірусного фактору у виникненні стеатозу мають суттєве значення метаболічні зміни у хвори х на ХГС, зокрема порушення ліпідного обміну [Zejc-Bajsarowicz Μ., Ciesla Α., Mach Τ. et al. Changes of lipid metabolism in patients with chronic viral hepatitis treated with interferon alfa //Przegl. Lek. -2005.- 62(4). -P.214-217], тому наявність капсидного білка HCV вірусу не є адекватним методом оцінки стеатозу печінки у хворих на її хронічну патологію. Основним недоліком аналогу є те, що використання лише вмісту тригліцеридів в сироватці крові 4 для визначення СП, має низьку специфічність, що призведе то хибнопозитивних результатів обстеження у хворих на хронічну патологію печінки, що може стати причиною невиправданого призначення лікування СП при його відсутності. Одним з варіантів оцінки СП було визначення рівня сироваткового адіпонектину [Petit J.M., Minello Α., Jooste V.Decreased plasma adiponectin concentrations are closely related to steatosis in hepatitis С virus-infected patients //J. Clin. Endocrino.1 Metab. -2005 Apr;90(4).- P.2240-2243]. За твердженням авторів зниження цього показника супроводжується збільшенням відкладень жирових краплин в тканині печінки. Проте запропонований спосіб трудомісткий, потребує висококоштовних реагентів, та суттєвим недоліком цього методу є залежність показника сироваткового адипонектину від індексу маси тіла пацієнтів. За даними аналога [Ellidokuz Ε., Comlekci Α., Ellidokuz Η. et al. The role of serum leptin levels in chronic hepatitis С with steatosis //Hepatogastroenterology. -2003.- Dec;50 Suppl 2.P.1419-1422] при обстеженні 31 пацієнта хворого на хронічний гепатит діагностичним маркером щодо наявності СП є вміст лептину в сироватці крові. Проте визначення цього показника потребує висококоштовного лабораторного обладнання, коштовних реактивів, а зростання концентрації лептину не є специфічним для СП, а супроводжує також метаболічний синдром. Крім того в інших дослідженнях [Giannini Ε., Серра P., Botta F. et al. Leptin has no role in determining severity of steatosis and fibrosis in patients with chronic hepatitis С //Am. J. Gastroenterol.- 2000.- Nov;95(11). -P.3211-3217] встановлено, що сироватковий рівень лептину немає кореляційних зв'язків із СП у хворих на хронічну патологію печінки. В способі прототипі [Hornboll P., Olsen T.S. Fatty changes in the liver: the relation to age, overweight and diabetes mellitus //Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. -1982. -May;90(3). -P.199-205] запропонована оцінка вираженості стеатозу печінки за відсотком гепатоцитів, які містять жирові вакуолі. Так, 1 ступінь визначається, коли жирові краплі визначаються в 1/3 гепатоцитів, 2 ступінь - між 1/3 та 2/3, 3 ступінь - більш ніж в 2/3 гепатоцитів. Цей метод за сутністю найбільш схожий із запропонованим, тому обраний в якості прототипу. Основним недоліком прототипу є те, що цей метод не враховує конкретну зону печінкових часточок, де відбувається відкладення жирових крапель (центролобулярну, портальну, перипортальну), цей метод є напівкількісним, та суттєво залежить від кваліфікації морфолога. У зв'язку з вищевикладеним, в основу корисної моделі покладено задачу підвищення точності морфометричної оцінки вираженості СП у хворих на її хронічну патологію, шляхом встановлення питомої площі ліпідних гранул в різних зонах печінкових часточок та оцінка впливу морфологічних ознак на прогресування фіброзу печінки, що дозволить суттєво підвищити інформативність морфологічного обстеження хворих на хронічну пато 5 37349 логію печінки та визначати найбільш інформативні морфометричні ознаки. Поставлена задача вирішується в способі діагностики СП у хворих на хронічну патологію печінки за допомогою додаткового включення до морфометричного обстеження біоптатів печінки показника - площі ліпідних крапель в перипортальній зоні печінкових часточок. Підставою для цієї пропозиції була вперше встановлена закономірність, яка полягає в тому, що прогресування фіброзу при хронічній патології печінки, в найбільшій мірі залежить від вираженості відкладень жирових крапель в перипортальній зоні часточок та найбільший вплив СП на фіброгенез має при перевищенні цього показника - 24,7%. Під час численних досліджень встановлено, що вказаний спосіб є вірогідним методом морфометричної оцінки СП у хвори х на хронічну патологію печінки, незалежно від віку, статі хворого, індексу маси тіла та відзначається тільки наявністю жирових крапель в тканині печінки. Спосіб здійснюється таким чином: у хворих на хронічну патологію печінки шляхом морфологічного дослідження біоптату печінки визначають питому площу ліпідних гранул периферійної зони печінкових часточок, та при перевищенні цього показника - 24,7%, встановлюють виражений стеатоз печінки. При розробці заявленого способу для його клінічного і патогенетичного обґрунтування було обстежено 44 хворих на ХГС у віці від 19 до 66 років, з яких 34 особи чоловічої статі і 10 - жіночої. Діагноз ХГС встановлений на підставі комплексу клініко-біохімічних показників, підтверджувався визначенням антитіл-анти-HCV і полімеразною ланцюговою реакцією - HCV-RNA, проведенням УЗД органів черевної порожнини з визначенням розмірів печінки, її ультразвукової щільності, стану судин, жовчовивідних шляхів. Для виключення вірусних гепатитів іншої етіології проводилось дослідження HbsAg, HbeAg, анти-HbeAg, анти-Hbclg Μ, анти-Hbc сумарні, анти-Hbs, анти-HDV. Біопсія печінки проводилась під контролем УЗД під місцевою анестезією. Величина фрагменту печінкової тканини, яка була отримана при біопсії, була більш 10мм. Для фарбування гістологічних зразків нами були використані методи фарбування: гематоксиліном і еозином, пікрофуксином за Ван Гізон, визначення стеатозу тканини печінки за методикою [Hornboll P., Olsen T.S. Fatty changes in the liver: the relation to age, overweight and diabetes mellitus //Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. -1982. Ma y;90(3). -P.199-205]. Стадія фіброзу визначалась за METAVIR [The French METAVIR Cooperative Study Group. Intraobserver and interobserver variations in liver biopsy interpretation in patients with chronic hepatitis С //Hepatology. -1994. -N20. -P.1520], індекс гістологічної активності за Knodell R.G. et al. [Knodell R.G., Ishak K.G., Black W.C. et al. Formulation and application of a numeral scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis //Hepatology. -1981. -№1. P.431-435]. Група хворих на ХГС була розподілена на 2 групи за ознаками активності процесу. До групи із 6 малою активністю ХГС (ІГА за Knodell 1-8 балів) увійшло 27 (61,4%) чоловік, з помірною активністю (ІГА за Knodell 9-15 балів) - 17 (38,6%). Серед 44 обстежених до групи із стадією фіброзу F0 - 4 хворих (9,1%), F1 - 12 (27,3%), F2 - 11 (25,0%), F3 - 10 (22,7%), F4 - 7 (15,9%) хвори х на ХГС. Вираженість стеатозу визначалася за методикою Hornboll P., 1982 [Hornboll P., Olsen T.S. Fatty changes in the liver: the relation to age, overweight and diabetes mellitus //Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. 1982. -May;90(3). -P.199-205], де 1 ступінь стеатозу - коли жирові вакуолі визначаються в 1/3 гепатоцитів, 2 ступінь - жирові вакуолі визначаються більш ніж в 1/3 гепатоцитів і 3 ступінь - жирові вакуолі мають місце більш ніж в 2/3 гепатоцитів. Нами також для оцінки вираженості стеатозу у хворих на ХГС був використаний спеціалізований пакет прикладних програм "Morpholog" [Овчаренко В.В., Маврич В.В., 2003; свідоцтво про реєстрацію авторського права №9604], який був створений на кафедрі нормальної анатомії людини ЛДМУ (завідувач - професор В.Г.Ковешніков). Отримані в результаті роботи програми дані морфометричного дослідження експортувалися в програму Excel для подальшої статистичної обробки. В кожному отриманому зображенні гістологічного препарату визначались такі параметри: питома площа відкладення ліпідних гранул (ЛГ) в гістологічних зрізах печінки хворих на ХГС (ППЛГ), кількість гепатоцитів в обстеженій ланці часточок, середня площа ліпідних гранул на 1 гепатоцит (СПЛГ). ППЛГ була отримана діленням площі відкладень ЛГ в досліджуваній ланці тканини печінки на загальну площу цієї ланки. СПЛГ була обчислена шляхом діленням площі ЛГ на кількість гепатоцитів в цієї ж ланці печінки. Всі морфометричні дослідження проводились в 3 зонах часточок: центролобулярній, перипортальній і портальній. Контроль лабораторних показників ліпідного обміну і комп'ютерної ХЛ проводився за результатами обстеження 32 практично здорових осіб (донорів крові). Віковий і статевий склад груп співставлення суттєво не відрізнявся. Статистичну обробку отриманих матеріалів проводили на комп'ютері Athlon ХР 2500+ за допомогою програми Statistica 6. В результаті проведених досліджень нами було встановлено, що у хворих на ХГС в тканині печінки спостерігається жирова і білкова дистрофія гепатоцитів, поліморфізм їх ядер, фокальні і ступінчасті некрози, запальна інфільтрація часток і портальних трактів. Також мали місце портальний і синусоїдальний склероз, формування сполучнотканинних септ. В загальній групі хворих на ХГС стеатоз печінки був верифікований у 26 з 44 пацієнтів (59,1%). За стадіями стеатозу за Hornboll група хворих на ХГС була розподілена таким чином: 1 ступінь стеатозу - 6 хворих (2, 6%), 2 ступінь - 11 (25,0%), 3 ступінь - 9 (20,5%), відсутність стеатозу - 18 хворих (40,9%). В групі з мінімальною гістологічною активністю (1-8 балів за Knodell) стеатоз був у 14 з 27 хворих (51,9%), в групі з помірною активністю -у 12 з 17 (70,6%). 7 37349 При мікроскопічному дослідженні було встановлено, що початкова ступінь стеатозу супроводжується відкладенням ліпідів переважно в центролобулярній зоні часточок. При прогресуванні стеатозу дрібногранулярний стеатоз в центролобулярній зоні трансформується у великогранулярний, а в перипортальній зоні з'являються спалахи дрібногранулярного стеатозу. При зростанні до 3го ступеня стеатозу його характер змінюється на великогранулярний не тільки в центролобулярній зоні, а й в перипортальній. При комп'ютерному морфометричному аналізі нами було встановлено, що питома площа ліпідних гранул (ЛГ) при малій гістологічній активності ХГС найбільша в центролобулярній зоні (28,6±2,4%), що в 1,4 рази перевищує значення перипортальної зони часточок (21,0±2,8%; p