Спосіб діагностики трихомоніазу

Спосіб діагностики трихомоніазу шляхом виділення трихомонад з біоматеріалу та подальшої їх культивації і виявлення у культуральному середовищі за допомогою фазово-контрастної мікроскопії за характерними ознаками збудника, який відрізняє ться тим, що культивацію найпростіших проводять в мікротермостаті, змонтованому на мікроскопі, в герметизованих мікрокамерах, які утворюються між предметним та накривним склом, 3 39256 4 статньої простоти виконання в короткий термін та ливість одержання відео- та фото- документації поставити пропонований спосіб на якісно новий дослідження та розміщення її на різноманітних рівень в галузі діагностики трихомоніазу шляхом інформаційних носіях в тому числі й цифрових, що виділення трихомонад з досліджуваного біоматемає суттєве значення при розв'язанні складних ріалу та подальшою їх культивацією в мікротермодіагностичних випадків, а також надання цієї докустаті в герметизованих прозорих мікрокамерах з ментації хворим, що значно підвищує їх довіру у культуральним середовищем для трихомонад та вірогідність діагностики, довіру до лікаря та стає подальшою їх ідентифікацією за допомогою ФКМ вирішальним для розв'язання конфліктних ситуаза характерними ознаками збудника. цій між лікувальним закладом та хворим у відноПоставлена задача досягається тим, що дошенні діагностики та лікування урогенітальних сліджуваний біоматеріал у якому передбачають інфекцій. наявність життєздатних трихомонад вносять до Спосіб здійснюється таким чином. На чисте прозорих плоских мікрокамер з культуральним сухе предметне скло (бажано, але необов'язково середовищем для трихомонад, які надалі герметистерильне та підігріте до 37,5°С), наносять 3 крапзують та вміщують до камери мікротермостату, лі (1 крапля приблизно 25мкл) рідкого стерильного який змонтований на мікроскопі. Надалі за допоспеціалізованого культурального середовища (бамогою ФКМ здійснюють огляд площини мікрокамежано, але необов'язково підігрітого до 37,5°С), яке ри для пошуку та ідентифікації в ній трихомонад за забезпечує пріоритетні умови для розмноження їх за характерними ознаками. В разі виявлення трихомонад та пригнічення розвитку сторонньої збудника подальші етапи пропонованого способу мікрофлори. Надалі на предметне скло в поживне припиняють та діагностику вважають закінченою. середовище вносять 1 краплю біологічного матеВ разі відсутності трихомонад при пошуку на даріалу, в якому передбачають наявність трихомоному етапі дослідження мікрокамери з культуранад та перемішують біоматеріал та поживне серельним середовищем та внесеним до них біоматедовище. Співвідношення біоматеріалу та ріалом інкубують в мікротермостаті (або іншому культурального середовища становить 1:3. Біолотермостаті) при оптимальній для культивації збудгічний матеріал від хворих, підозрілих на трихомоника температурі. Надалі періодично з інтервалом ніаз вносять в рідке стерильне спеціалізоване 6-12 годин за допомогою ФКМ здійснюють огляд культуральне середовище, яке забезпечує пріориплощини мікрокамери для пошуку та ідентифікації тетні умови для розмноження трихомонад. Потім в ній трихомонад за їх характерними ознаками. В цю рідку суміш накривають чистим сухим накривразі виявлення збудника подальше дослідження ним склом (бажано, але необов'язково стерильприпиняють та діагностику вважають закінченою. ним). Таким чином утворюється інкубаційна мікроОптимальний термін дослідження становить 48-72 камера, периферію якої (по краю накривного скла) годин, але при необхідності може бути подовжепоступово та повільно герметизують розплавлений до 7 днів. ним парафіном (температура плавлення якого 45Суттєвою відмінністю запропонованого спосо55°С) таким чином, щоб не привести до підвищенбу від аналогів є те, що він дозволяє: повністю ня температури в мікрокамері вище 40°С. виключити періодичний та неодноразовий забір Слід особливо наголосити, що треба вибирати матеріалу із культурального середовища для мікнакривне скло такого розміру, щоб при утворенні роскопічного дослідження на наявність трихомомікрокамери рідина з неї не виходила за межі нанад; повністю виключити етапи пересіву матеріакривного скла. Це нескладно і такий підбор здійслу; повністю виключити можливість бактеріальної нюється заздалегідь використовуючи звичайний та грибкової контамінації культурального середофізіологічний розчин або навіть звичайну чисту вища на протязі періоду дослідження вже після воду. Такі умови необхідні для забезпечення безвнесення біоматеріалу від хворого або живої кульпеки у відношенні заразного біоматеріалу. тури трихомонад (при вивченні їх властивостей) Слід зазначити, що мікрокамери з поживним так як відсутні періодичний забір матеріалу на досередовищем можна створювати до внесення біослідження та етапи пересіву; значно скоротити час матеріалу в культуральне середовище, що попедослідження з 3-11, а інколи і 17 днів - до 12-72 редить перегрів інкубаційної суміші в мікрокамері годин (в 3-8 разів); значно зменшити витрату реакпри її герметизації розплавленим парафіном. Пістивів, лабораторного посуду, зекономити місце в ля нанесення культурального середовища на лабораторії та зменшити навантаження на її облапредметне скло наносять накривне скло таким днання та працівників; забезпечити постійний мочином, щоб у однієї з стінок мікрокамери утворивбільний доступ до об'єкта дослідження, а також ся вільний простір, приблизно рівний 1/3 її об'єму. його постійне та мобільне прижиттєве спостереДалі бокові стінки утвореної мікрокамери герметиження в реальному часі, що в свою чергу дає мозують розплавленим парафіном, залишаючи негежливість детального вивчення культивації трихорметизованою одну з бокових стінок, яка є гранимонад та створення на базі дослідження цею вільного простору в мікрокамері. Вільна математичних моделей життєдіяльності збудника; негерметизована бокова стінка мікрокамери по забезпечити можливість вивчення дії на трихомосуті стає її отвором, а сама камера - капіляром, нади різноманітних стимулюючи х та пригнічуючих стінки якого мають властивість змочуватися кульжиттєдіяльність збудника факторів та завдяки туральним середовищем, що обумовлено властицьому забезпечити вивчення чутливості трихомовостями предметного та накривного скла. Потім над до антипротозойних засобів. мікрокамеру вміщують в термостат при темпераТакож суттєвою відмінністю пропонованого турі 37,5°С та надають їй час охолонути. Надалі в способу від аналогів також є: портативність; можотвір мікрокамери вносять 1 краплину досліджува 5 39256 6 ного біоматеріалу, який потрапляє до мікрокамери мент (12-48 годин культивації), у який кількість за рахунок капілярних сил. Після внесення біомазбудника значно зростає, що дозволяє за допомотеріалу в мікрокамеру його залишки обережно гою ФКМ зафіксувати наявність мікроорганізмів з видаляють фільтрувальним папером, який потім характерними ознаками трихомонад у мікрокамезнезаражують в дезінфікуючому розчині. Потім рах, як візуально, так і за допомогою перегляду мікрокамеру вміщують в термостат на декілька відеозаписів. хвилин (до 5-ти) для надання можливості змішатиПри наявності відеосистеми для мікроскопії з ся культуральному середовищу та біоматеріалу. детектором руху і відеозапису та обладнання мікНадалі вільну стінку мікрокамери поступово та роскопа мікротермостатом на другому етапі досліповільно герметизують розплавленим парафіном. дження настроюють систему відображення мікроНеобхідно відзначити, що безумовна стерильоб'єктів в мікрокамері та встановлюють ність мікрокамер не передбачається тому, що в відеосистему в режим відеозапису з її ініціацією середовище (СКДС, СДС-199, Trichomonas детектором руху. Для пропонованого способу діагmedium 1 Oxoid або інші) для культивації трихомоностики використовувались відеосистеми на базі над введені антибактеріальні та антигрибкові пренедорогих цифрових комп'ютерних Web - камер з парати, які не дозволяють розмножуватися стороздільною здатністю 1,3 мегапікселів або чорно роннім мікроорганізмам та разом із складом білих мініатюрних аналогових камер з роздільною самого поживного середовища забезпечують пріоздатністю не менше за 420 телевізійних ліній [Боритетні умови для культивації саме трихомонад. ндаренко А.Н. Конструкция видеосистемы для Слід також зазначити, що при створенні мікрокалабораторных исследований //Клиническая лабомери об'єми поживного середовища та біоматеріраторная диагностика. - 2004. - №3. - С.52-54.] алу порівнянні. Тому, щоб уникнути зменшення Надалі періодично з інтервалом 6-12 годин кінцевої концентрації компонентів поживного сепереглядають відеозапис для пошуку та ідентифіредовища в мікрокамері для пропонованого спокації трихомонад за їх характерними ознаками. собу бажано використовувати спеціалізовані поСаме суттєва властивість живих трихомонад - знаживні середовища із збільшеною на 1/3 від чна рухома активність дозволяє здійснювати ініцівихідної концентрацією, виходячи з співвідношенйований детектором руху відеозапис тільки при ня біоматеріалу та поживного середовища в мікронаявності в полі зору рухомих об'єктів та припинякамері. ти запис при їх зупиненні. Це надає наступні сутНа першому етапі предметне скло із змонтотєві переваги - можливість постійного мобільного ваною на ньому мікрокамерою розміщують в мікспостереження в мікрокамері; скорочення терміну ротермостат мікроскопа, який обладнаний систевідеозапису, що дозволяє скоротити перегляд замою ФКМ. Далі настроюють систему ФКМ, пису дослідником, та тим самим скоротити термін використовуючи маслоімерсійний об'єктив з кратдослідження, а також зекономити дисковий простір ністю збільшення х90 та відеосистему для мікропри цифровому записі або відеоплівку при записі скопії. У разі відсутності відеосистеми використона аналогову систему. вують замість неї окуляри з кратністю збільшення Вважаючи те, що за допомогою відеосистеми х7, х10 або х15. за інтервал часу між переглядами відеозаписів За допомогою ФКМ здійснюють послідовний здійснюється постійне спостереження тільки за огляд площини мікрокамери для пошуку та іденодним з сегментів площини мікрокамери, необхідтифікації в ній трихомонад за їх характерними но в разі відсутності виявлення трихомонад при ознаками: активно рухомі навпіл прозорі мікроорперегляді відеозапису переглянути всю площину ганізми грушоподібної або овальної форми з наявмікрокамери за допомогою ФКМ. У разі виявлення ністю джгутиків, мембрани, що ундулює, аксостизбудника дослідження припиняють. Якщо збудник лю та розмірів порівнянних з лейкоцитами та не виявлений, дослідження продовжують, а ФКМ з епітеліальними клітинами. При виявленні збудника відеосистемою настроюють на запис іншого від діагностику вважають закінченою і дослідження попереднього сегменту площини мікрокамери. припиняють. Якщо пошук трихомонад при мікроЯкщо через 72 години в досліджуваному маскопії не дав результатів, переходять до другого теріалі трихомонади не виявлені, термін досліетапу дослідження. Мікрокамери надалі інкубують дження можна подовжити до 7 днів. Однак у більв мікротермостаті (або іншому термостаті) при шості випадків (92,3%) при культивації в оптимальній для культивації трихомонад темперамікрокамерах трихомонади при їх наявності в дотурі (37,5°С). Періодично з інтервалом 6-12 годин сліджуваному біоматеріалі були виявлені в перші 3 за допомогою ФКМ здійснюють огляд площини доби дослідження і тільки у 7,7% випадків обстемікрокамери для пошуку та ідентифікації в ній триження трихомонади виявлялись після 3 діб кульхомонад за їх характерними ознаками. В разі витивації. Тому при відсутності виявлення трихомоявлення збудника подальше дослідження припинад після 3 діб культивації біоматеріалу в няють і діагностику вважають закінченою. мікрокамерах за пропонованим способом продовОптимальний термін дослідження не перевищує ження терміну дослідження недоцільне. В даному 48-72 годин, але може біти подовжений до 70 днів. випадку та при збереженні підозри на вміст у біоПо закінченню дослідження мікрокамери обов'язматеріалі трихомонад для діагностики хвороби ково знезаражують в автоклаві. слід застосувати більш чутливі методи, а саме При наявності в біологічному матеріалі життєполімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). здатних трихомонад, вони в оптимальних умовах Пропонований спосіб може бути використаний починають активно розмножуватись та вільно рудля вивчення чутливості три хомонад до антитрихатись в межах мікрокамери. Настає часовий мохомонадних препаратів. Для цього замість біома 7 39256 8 теріалу від хворих використовують чисту культуру тативність та не дає можливості одержання фототрихомонад, а в поживне середовище вводять або відеодокументації. антитрихомонадний препарат. Надалі за пропоноСпосіб пояснюється такими прикладами. ваним способом створюють мікрокамеру, вміщуПриклад 1 ють її в мікротермостат мікроскопу та за допомоДосліджувався біоматеріал (виділення з піхви) гою ФКМ здійснюють спостереження за хворої Д., 35 років з підозрою на урогенітальний життєдіяльністю збудника. Термін спостереження трихомоніаз за пропонованим способом. Після 24 години. У якості контролю використовують мікзмішування біоматеріалу з поживним середовирокамеру, в якій поживне середовище з культурою щем на предметному склі та створення мікрокаметрихомонад не вміщує антитрихомонадний препари її вміщено в мікротермостат (встановлена темрат. пература 37,5°С), змонтований на мікроскопі. За Нижче наведене основне необхідне забезпедопомогою ФКМ проведений перегляд верхньої чення пропонованого способу: 1. Предметне та площини мікрокамери. При перегляді в полі зору накривне скло, зонди для забору біоматеріалу, виявлені активно рухомі трихомонади. лабораторний посуд (чистий, бажано стерильний), Висновок: У хворої діагностовано урогенітальдозатори, парафін (стеаринова або парафінова ний трихомоніаз. Подальші етапи дослідження за свічка), пальник; 2. Спеціалізоване стерильне пропонованим способом припинені. культуральне середовище для трихомонад, яке Приклад 2 забезпечує їм пріоритетні умови життєдіяльності Досліджувався біоматеріал (виділення з уретта розмноження (середовище СКДС, СДС-199, ри) хворого М., 25 років з підозрою на урогенітальTrichomonas medium I Oxoid або інші); 3. Мікроскоп ний трихомоніаз за пропонованим способом. Після (серії МБР, МБИ, БИОЛАМ або інший) з насадкою змішування біоматеріалу з поживним середовидля ФКМ (типу КФ-4, КФ-4M) або вмонтованою щем на предметному склі та створення мікрокамесистемою ФКМ (МЛ-2, ЛЮМАМ, ЛЮМАМ-РПО або ри, вміщення її в мікротермостат (встановлена інший); 4. Освітлювач для мікроскопу (вмонтоватемпература 37,5°С), змонтований на мікроскопі. ний або відокремлений); 5. Столик - мікротермосЗа допомогою ФКМ перегляд верхньої площини тат для мікроскопу (типу "Столик - термостат" Хармікрокамери не виявив мікроорганізмів з характерківського заводу медобладнання або інший); 6. ними ознаками трихомонад. Дослідження продовВідеосистема (цифрова комп'ютеризована або жено з залученням цифрової відеосистеми, яка звичайна аналогова) у вигляді відеоокуляра або має детектор руху. Систему фазово-контрастної відеоприставки до мікроскопа та можливістю запивідеомікроскопії налагоджено на чітке зображення су на різноманітні носії інформації за допомогою скупчення клітин (лейкоцитів та епітелію) та встакомп'ютера або відеомагнітофона і бажано з детеновлено на запис, який ініціюється детектором ктором руху; 7. У разі використання цифрової відруху. Через 24 години проведений перегляд відеоеосистеми (цифрової фото- або відеокамери) незапису. Наприкінці перегляду виявлені активно обхідний монітор (бажано з діагоналлю 17) та рухомі трихомонади. комп'ютер з мінімальними вимогами до процесора Висновок: У хворого діагностовано урогеніта- Intel Pentium III - 500МГц та операційної системи льний трихомоніаз. Подальші етапи дослідження Windows 98 SE; 8. У разі використання аналогової за пропонованим способом припинені. відеосистеми також можна використовувати комПропонований спосіб заснований на результап'ютер з наведеними вище характеристиками але тах дослідження 40 завідома позитивних та 30 доукомплектувати його платою відеозахвату або завідома негативних за наявністю життєздатних телевізійним тюнером, або використати звичайний трихомонад зразків біоматеріалу від хворих за телевізор (наявність кольорового зображення неданими культурального методу та ПЛР. Результаобов'язкова) та відеомагнітофон. ти порівняльного співставлення пропонованого При необхідності або в разі відсутності забезспособу з іншими методами діагностики трихомопечення способу відеосистемою та мікротермосніазу, які проводились паралельно, надані в Табтатом культивацію в мікрокамерах проводять у лицях 1 і 2. У якості діагностичного стандарту були звичайному термостаті типу ТС-80 або іншому, а обрані культуральний метод та ПЛР, які мають виявлення трихомонад в мікрокамерах проводять самі високі показники чутливості та специфічності візуально за допомогою ФКМ. Завдяки цьому просеред існуючих методів діагностики трихомоніазу. понований спосіб діагностики може бути повністю Чутливість та специфічність обраного стандарту виконаний і без застосування відеосистеми та мікбули прийняті за 100%. В Таблиці 1 наведені дані ротермостату, що дає можливість проводити діагпорівняльного співставлення чутливості пропононостику за пропонованим способом у широкій меваного способу, ФКМ та імунофлюоресцентного режі лабораторій, які не обладнані комп'ютерами методу (ІФМ) з обраним стандартом при досліта системами відеовідображення, але це збільшує дженні біоматеріалу з завідомою наявністю в ньочас дослідження в 1,5 рази, зменшує його резульму життєздатних три хомонад. 9 39256 10 Таблиця 1 Порівняльне співставлення чутливості пропонованого способу з різними методами діагностики трихомоніазу Метод діагностики (n-число досліджень) Пропонований спосіб (n=40) Фазово - контрастна мікроскопія (n=40) Імунофлюоресцентний метод (n=40) Культуральний метод (n=40) - обраний стандарт Полімеразна ланцюгова реакція (n=40) обраний стандарт Число позитивних результатів 37 23 35 Число хибнонегативних результатів 3 17 5 Чутливість методу % 92,5* 57,5*,**, g 87,5** 40 0 100 40 0 100 *,** - вірогідність розбіжностей між показниками в колонці (р