Спосіб лікування травматичних ушкоджень периферійного нерва (в експерименті)

Спосіб лікування травматичних ушкоджень периферійного нерва (в експерименті), що включає застосування лікарського препарату, який відрізняється тим, що відразу після оперативного втр учання призначають щодобово, протягом 21 доби, масляний розчин омега-3-поліненасичених жирних кислот у дозі 0,04 г/кг всередину на кукурудзяній олії. (19) (21) u200814348 (22) 15.12.2008 (24) 25.02.2009 (46) 25.02.2009, Бюл.№ 4, 2009 р. (72) КОРСАК АЛІНА ВАДИ МІВН А, U A, ЧАЙКОВСЬКИЙ ЮРІЙ БОГДАНОВИЧ, UA, СТЕЧЕНКО ЛЮДМИЛА ОЛЕКС АНДРІВН А, U A (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ О.О. БОГОМОЛЬЦЯ, UA 3 39562 найбільш досконалим є препарат Епадол, який виготовляє «Київський вітамінний завод». Він випускається у вигляді желатинових капсул по 0,5 г субстанції. В якості антиоксиданта в кожній капсулі міститься 0,5 мг альфа-токоферола. Результати попередніх досліджень, показали, що епадол має виражену гіпокоагуляційну, антиагрегантну, протизапальну, імуномодулюючу, антиатерогенну дію, не має суттєвих побічних ефектів та є мембранопротектором [3,7,10]. Препарати омега-3 ПНЖК в теперішній час з успіхом застосовують при захворюваннях легень, ішемічної хвороби серця, атеросклерозі. Включення препарату Теком в комплексне лікуванні пацієнтів із захворюваннями легень, що ускладнені хронічним легеневим серцем, дозолило зменшити прояви синдрому гіперкоагуляції крові, підтвердженням цього були зміни показників автокоагуляційного, етанолового тестів, вміст фібриногену, розчинного фібрину, тесту з АДФіндукованою агрегацією тромбоцитів. При цьому спостерігалась позитивна динаміка клінічного стану хворих, що могло бути пов'язано з покращенням реологічних властивостей крові та зменшенням легенево-судинного опору. Протизапальні та імуномодулюючі властивості препаратів омега-3 ПНЖК були підтверджені при лікуванні хворих на туберкульоз. Імуномодулюючі властивості, в даному випадку, проявляються у вигляді стимуляції Т-клітинного та макрофагального ланок імунітету, а протизапальні - у вигляді зменшення фібротизації тканин легень. При лікуванні хворих з а терогенною гіперліпідемією препаратом Теком, позитивний вплив омега-3 ПНЖК на стан ліпідного обміну зберігався в середньому в на протязі двох місяців після відміни препарату. Припускають, що вплив на ліпідний обмін омега-3 ПНЖК пов'язаний із структурними змінами ліпопротеїдів, які залежать від вмісту в них жирних кислот. Універсальний характер впливу омега-3 ПНЖК, обумовлює необхідність подальшого дослідження застосування цієї речовини в інших областях медицини. Враховуючи результати попередніх досліджень впливу омега-3-поліненасичених жирних кислот на організм, їх біологічну роль та закономірності будови і процесу регенерації периферійних нервів ми припустили, що дана речовина може позитивно вплинути на відновлювальні процеси у нервовому стовбурі. Підставою для цього є поперше те, що омега-3-поліненасичені жирні кислоти є природним компонентом біологічних мембран, які є основною складовою мієлінової оболонки; друге - омега-3-поліненасичені жирні кислоти, що надійшли з їжею або у вигляді фармакологічного препарату мають можливість вбудовуватись в мембрани клітин; трете - омега-3-поліненасичені жирні кислоти мають протизапальну, гіпокоагуляційну та антиагрегантну дію, що позитивно впливає на дозрівання сполучної тканини, яка є головною перепоною на шляху новоутворених нервових волокон. У сучасній літературі з'явились відомості про застосування ліпосомальних препаратів в лікуван 4 ні травм периферійних нервів. До цієї групи належить ліпін фармакологічна дія якого основана на можливості вбудовування в бімолекулярні ліпідні мембрани [10], стимулюючи при цьому мієлінізацію ушкоджених нервових волокон. Найбільш близьким за технічними характеристиками до способу, що заявляється є спосіб застосування ліпіну у щурів з пошкодженням периферійних нервів, який виступає в якості прототипу (8). Цей спосіб передбачає: через два тижні після оперативного втручання щодобово, протягом 10 діб вводять підшкірно суспензію ліпіну у дозі 16-18 мг/кг, чим забезпечувалось утворення депо ліпіну до початку процесів мієлінізації в нервових волокнах. Однак цей спосіб має недоліки: 1. Вивчався вплив ліпіну на дистальний відділ ушкодженого нерва, зокрема тільки на процес мієлінізації новоутворених нервових волокон, не звертаючи увагу на процес дегенерації, що йде попереду процесу регенерації. 2. Відсутні відомості про вплив ліпіну на якість новоутвореного мієліна за рахунок не тільки збільшення товщини мієлінової оболонки, але і збільшення кількості пластин мієліну на одиницю товщини останньої. 3. Введення ліпіну підшкірно не завжди є оптимальним шляхом введення лікарського засобу в клінічних умовах. Задача корисної моделі, що заявляється полягає в розробці способу, який передбачає застосування препарату, що ефективно впливав би одночасно на декілька ключових процесів регенерації (включаючи процес мієлінізації) та процес дегенерації нервових стовбурів та показників, які дозволяють оцінити цей вплив і покращити ефективність фармакотерапії даного захворювання. Технічний результат, який досягається полягає у позитивному впливі омега-3-поліненасичених жирних кислот на декілька ключових процесів регенерації (включаючи якість новоутвореного мієліна) нервових стовбурів та прискорення елімінації продуктів вторинної дегенерації. Поставлена задача досягається тим, що у відомому способі, що передбачає застосування лікарського препарату, згідно корисної моделі відразу після оперативного втр учання щодобово призначають протягом 21 доби, масляний розчин омега-3-поліненасичених жирних кислот у дозі 0,04 г/кг всередину на кукурудзяній олії, а також аналізують щільність розподілу нервових волокон та середній кут відхилення нервових волокон від поздовжньої осі нерва в ділянці регенераційної невроми; кількість овоїдів дегенерації нервових волокон в одиниці об'єму нерва, об'єм овоїдів дегенерації нервових волокон в одиниці об'єму нерва та розміри овоїдів дегенерації нервових волокон, а саме - середній периметр та середню площу у дистальному відділі ушкодженого нерва; товщину мієлінової оболонки нервових волокон та кількість пластин мієліну на одиницю товщини мієлінової оболонки нервових волокон у дистальному відділі ушкодженого нерва. Спосіб здійснювався наступним чином: досліди проведені на 70 щурах. Тварин розподілили на 4 групи: Перша група (І) - інтактні тварини (5 щурів), показники будови яких були використані для 5 39562 оцінки стану сідничого нерва "псевдооперованих" тварин. Друга група (II) - "псевдооперовані" тварини (5 щурів), показники будови яких були використані для оцінки відновлення травмованих нервів (контроль). Третя група (III) - 30 щурів, яким була відтворена запропонована експериментальна модель травми периферійного нерва. Четверта група (IV)- 30 щурів, яким була відтворена запропонована експериментальна модель травми периферійного нерва за умов застосування омега-3поліненасичених жирних кислот. Тваринам третьої групи відразу після оперативного втручання щодобово, протягом 21 доби, вводили масляний розчин кукурудзяної олії у дозі 1 мл всередину. Тваринам четвертої гр упи відразу після оперативного втручання щодобово, протягом 21 доби, вводили масляний розчин омега-3-поліненасичених жирних кислот у дозі 0,04 г/кг всередину на кукурудзяній олії. Матеріалом для дослідження були регенераційні невроми з прилеглими відрізками (центральним, або проксимальним і периферійним, або дистальним) ушкодженого сідничого нерва через 3, 6, 12 тижнів після відтворення моделі травми периферійного нерва. Перед забором матеріалу тваринам вводили надлишкову дозу тіопенталу (200 мг/кг), а для електронної мікроскопії - летальну дозу ефіру. Для світлооптичної мікроскопії матеріал фіксували у 10 %-му розчині формаліну, промивали та отримували зрізи на заморожуючому мікротомі, які потім імпрегнували азотнокислим сріблом за швидким методом імпрегнації азотнокислим сріблом елементів периферійної нервової системи) з подальшим золотінням. Для вивчення сполучної тканини препарати забарвлювали азур ІІ-еозином. Для аналізу результатів світлооптичної мікроскопії за допомогою морфометрії використовували комп'ютерну програму UTHSCSA Image Tool for Windows (version 2.00) та стандартну окулярну вставку. Були визначені такі показники: щільність розподілу нервових волокон та середній кут відхилення нервових волокон від поздовжньої осі нерва в ділянці регенераційної невроми. Для аналізу результатів використовували також напівтонкі поперечні та поздовжні зрізи нервів, виготовлені на ультратомі LKB і забарвлені толуїдиновим синім. Морфометричні дослідження [1, 4, 6, 8], проводили за допомогою напівавтоматичного пристрою для обробки графічних зображень. У даному дослідженні визначали такі величини: кількість овоїдів дегенерації нервових волокон в одиниці об'єму нерва, об'єм овоїдів дегенерації нервових волокон в одиниці об'єму нерва та розміри овоїдів дегенерації нервових волокон, а саме середній периметр та середню площу. Препарати тонких і напівтонких зрізівфотографували за допомогою цифрової фотокамери та мікроскопу "Олімпус". Для електронномікроскопічного дослідження невеликі фрагменти дистальних відрізків сідничого нерва фіксували в 1 %-му розчині чотирьохокису осмію за Колфільдом протягом 2 годин при температурі +4 °С. Об'єкти зневоднювали в етанолі зростаючої концентрації, в ацетоні і заливали в суміш 6 епону з аралдитом за загальноприйнятою методикою. Ультратонкі зрізи одержували на ультратомі LKB-8800 (Швеція) в поздовжній та поперечній проекціях нерву, контрастували їх 2 %-м розчином уранілацетату в 50-70 %-му етанолі протягом 15 хвилин і азотнокислим свинцем стільки ж часу, а потім зрізи вивчали та фотографували в електронному мікроскопі ЭМВ 125К. Для аналізу результатів електронної мікроскопії за допомогою морфометрії використовували напівавтоматичний пристрій для обробки графічних зображень. Були визначені такі показники: товщина мієлінової оболонки нервових волокон, кількість пластин мієліну на одиницю товщини мієлінової оболонки нервових волокон. При статистичному аналізі морфометричних даних обчислювали середні значення величин, середнє квадратичне відхилення, похибку середньої, коефіцієнт варіації і коефіцієнт точності визначення середньої у відповідності з рекомендаціями, що містяться в підручниках з математичної статистики. Порівняння отриманих результатів проводили за допомогою непараметричного критерію Манна-Вітні-Вілкоксона. Дані проведених досліджень свідчать, що в четвертій групі тварин (яким була відтворена запропонована експериментальна модель травми периферійного нерва та застосовувались омега-3поліненасичені жирні кислоти) і в третій групі тварин травма сідничого нерва ініціює вторинну дегенерацію у периферійному відрізку та призводить до утворення регенераційної невроми між його центральним та периферійним відрізками. В ділянці регенераційної невроми виявляються елементи сполучної тканини, новоутворені кровоносні судини та регенеруючі нервові волокна. За результатами імпрегнації нітратом срібла, золотіння та дофарбування азур ІІ-еозином встановлено, що нейро-тканинна взаємодія в ділянці регенераційної невроми в гр упах тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва за умов застосування омега-3поліненасичених жирних кислот та без проходить не однаково. В динаміці експерименту кількість регенеруючих нервових волокон збільшується як у тварин третьої так і четвертої групи. Однак у тварин третьої групи регенеруючі нервові волокна в ділянці невроми розташовуються невпорядковано, а дозрівання сполучної тканини регенераційної невроми в цій групі тварин проходить нерівномірно. В динаміці експерименту через 12 тижнів в найбільшій кількості виявлені значні зони фіброзу із зниженим вазальним забезпеченням та значним скупченням колагенових волокон. У тварин четвертої групи регенеруючі нервові волокна в ділянці невроми розташовуються відносно впорядковано, а дозрівання сполучної тканини регенераційної невроми в цій групі тварин проходить досить рівномірно. В динаміці експерименту у тварин четвертої групи через 12 тижнів більше, ніж в попередні терміни зустрічаються малосудинні зони з ознаками помірного фіброзу, але кількість їх значно менша, ніж у тварин третьої групи в даний термін спостереження. 7 39562 У тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва за умов застосування омега-3-поліненсичених жирних кислот спостерігається утворення менш щільного, однорідного за будовою нейрального рубця внаслідок зміни нейро-тканинної взаємодії в регенераційній невромі, що проявляється збільшенням щільності розподілу волокон (9634±171/мм 2) та зменшенням середнього кута відхилення аксонів від поздовжньої осі нерва (34,78±2,15°) в ділянці регенераційної невроми в термін 12 тижнів після ушкодження в порівнянні з тваринами із запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва яким омега-3-поліненсичені жирні кислоти не вводились, де щільність розподілу волокон складає 7148±154/мм 2 та середній кут відхилення аксонів від поздовжньої осі нерва складає 45,22±2,59° в ділянці регенераційної невроми. Встановлено, що швидкість протікання процесів вторинної дегенерації периферійного відрізка травмованого нерва не однакова в групах тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва з застосуванням омега-3поліненасичених жирних кислот та без. Аналіз напівтонких зрізів периферійного відрізка сідничого нерва щура, забарвлених толуїдиновим синім, виявив у тварин третьої групи присутність овоїдів дегенерації великих розмірів в значній кількості. Однак у тварин четвертої групи овоїди дегенерації нервових волокон виявлені в значно меншій кількості та невеликих розмірів. У тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва за умов застосування омега-3-поліненсичених жирних кислот спостерігається прискорення процесу вторинної дегенерації, на відміну від групи тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва без застосування омега-3поліненсичених жирних кислот. Це підтверджується прискоренням елімінації продуктів вторинної дегенерації у вигляді достовірного зменшення об'єму овоїдів дегенерації нервових волокон в одиниці об'єму нерва (1,17±0,19 %), зменшення кількості овоїдів дегенерації нервових волокон в одиниці об'єму нерва (2,38±0,37×10-2/мкм 3) і зменшення їх розмірів, а саме площі та периметру, на відміну від групи тварин з експериментальною травмою периферійного нерва без застосування омега-3-поліненсичених жирних кислот де об'єм овоїдів дегенерації нервових волокон в одиниці об'єму нерва складає 5,67±0,09 %, кількість овоїдів дегенерації нервових волокон в одиниці об'єму нерва складає 4,24±0,53×10-2/мкм 3. Встановлено, що темп мієлінізації регенеруючих нервових волокон проходить не однаково в групах тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва за умов застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот та без. Дані електронної мікроскопії свідчать, що в третій та четвертій група х тварин в термін 12 тижнів виявляються регенеруючі новоутворені та зрілі нервові волокна різного діаметру. У тварин третьої групи регенеруючі нервові волокна виглядають деформованими з патологічними змінами мієлінової оболонки та осьових циліндрів. Однак у тварин 8 четвертої гр упи виявляється значно менше регенеруючих нервови х волокон з ознаками деформації. Більшість з них мають округлу або овальну форму з добре вираженою мієліновою оболонкою, яка утворена впорядкованими концентрично розташованими неперервними пластинами мієліну. У тварин із запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва за умов застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот спостерігається прискорення процесу мієлінізації, що полягає в підвищенні якості новоутвореного мієліна за рахунок не тільки збільшення товщини мієлінової оболонки, але і збільшення кількості пластин мієліну на одиницю товщини останньої. Це характеризується тим, що у віддалений термін спостереження (12 тижнів) у групі із запропонованою експериментальною моделлю травми периферійного нерва за умов застосування омега-3поліненсичених жирних кислот більша товщина мієлінової оболонки, яка складає 0,71±0,03 мкм та більша кількість пластин мієліна, яка складає 66,85±0,90/мм товщини мієлінової оболонки на відміну від групи із запропонованою експериментальною моделлю травми периферійного нерва де омега-3-поліненсичені жирні кислоти не застосовувались та у термін 12 тижнів товщина мієлінової оболонки становить 0,50±0,02 мкм, а кількість пластин мієліну - 63,80±0,72/мм товщини мієлінової оболонки. Наші досліди свідчать, що застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот в разі відтворення запропонованої експериментальної травми периферійного нерва покращує процес регенерації пошкодженого нервового стовбура. Проведене дослідження дозволяє припустити, що основними механізмами впливу омега-3-поліненасичених жирних кислот на процеси регенерації периферійного нерва є прискорення елімінації продуктів вторинної дегенерації; попередження розвитку щільного сполучнотканинного рубця в ділянці невроми, що сприяє проростанню більшої кількості новоутворених нервових волокон; покращення процесу мієлінізації. Таким чином, даний спосіб заключається в тому, що при введенні відразу після оперативного втр учання щодобово, протягом 21 доби, масляного розчину омега-3-поліненасичених жирних кислот у дозі 0,04 г/кг всередину відбувається покращення процесу регенерації пошкодженого нервового стовбура у вигляді прискорення елімінації продуктів вторинної дегенерації; попередження розвитку щільного сполучнотканинного рубця в ділянці невроми, що сприяє проростанню більшої кількості новоутворених нервових волокон; прискорюється процес мієлінізації, що полягає в підвищенні якості новоутвореного мієліна. ЛІТЕРАТУРА 1. Автандилов Г.Г., Яблучанский Н.Й., Губенко В.Г. Системная стереометрия в изучении патологического процесса. - М..: Медицина, 1981. - 192с. 2. Баюн Ю.В., Максимов В.Н., Потапов А.И., Худетский Ю.П. Материалы к клинике и лечению травмы нервных стволов //X всесоюзн. конфер. молодых нейрохир. - М., 2002. - Вып. 2. - С.25-27. 9 39562 3. Гаврисюк В.К., Ячник А.І., Морозова Н.А., Коржів В.І., Алферов A.M., Ле щенко С.І., Задорожная Е.С. Применение «омега-3 полиненасыщенных жирних кислот при синдроме гиперкоагуляции крови в модели воспалительного процесса в легких //Укр. пульмонолог, журн. - 1995. - №4. - С.4851. 4. Гуцол А.А. Практическая морфометрия органов и тканей /Гуцол А.А., Кондратьев Б.Ю. Томск: Изд-во Том. Ун-та, 1988. - 136с. 5. Кардаш К.А. Оптимізація надання допомоги хворим з ушкодженнями периферичних нервів //Український медичний альманах. - 2003. - Том 6. №5. - С.72-76 6. Лакин Г. Ф. Биометрия: Учебное пособие для университетов и педагогических институтов. М.: Высшая школа, 1973. - 343с. 7. Лещенко С.І. Вплив омега-3поліненасичених жирних кислот на систему згор Комп’ютерна в ерстка Д. Шев ерун 10 тання крові: перспективи застосування в пульмонології та фтизіатрії //Укр. пульмонолог, журн. 1997. - №3. - С.60-69. 8. Мінцер О.П., Вороненко Ю.В., Власов В.В. Оброблення клінічних і експериментальних даних у медицині: Навч. посіб. - К.: Вища школа, 2003. 350с. 9. Сокуренко Л.М. Регенерація периферійного нерва в , умовах нейропластики, проведеної в різні терміни після пошкодження, та стимуляції мієліногенезу: Дис. ... канд. мед. наук: 14.03.09. - К., 2003. - 175с. 10. Чайковский Ю.Б. Регенерационная неврома //Морфология. -1999. - П5. - №1. - С.55-67. 11. Челышев Ю.А. Молекулярные и клеточные аспекты фармакологической стимуляции регенерации нерва /Ю.А. Челышев, Г.В. Черепнев //Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2001. - Т.64. - №3. - С.67-71. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601