Спосіб цитогенетичної діагностики лімфопроліферативних процесів

Спосіб цитогенетичної діагностики лімфопроліферативних процесів, що включає кількісне ви 40230 джень авторами показана чітка залежність між рівнем проліферативної активності і ступенем злоякісної трансформації лімфоїдних клітин від кількості та розмірів АГ. Недоліком даного способу є те, що автори не відтворюють на своєму матеріалі диференціювання чотирьох основних активних і неактивних типів ядерець згідно із загальноприйнятою класифікацією вітчизняних авторів [7], а виділяють лише три типи розмірів АГ та їх розподілу у ядрі, не конкретизуючи у якому морфофункціональному типі ядерець досліджувалися дані гранули. Представлена авторами чітка залежність ступеня злоякісності ЛПП від кількості АГ не пояснює можливості зворотного співвідношення даних критеріїв, що, як ми пересвідчились за результатами власних досліджень і даних літератури [3], має місце і є відображенням особливостей клінічної поведінки НХЛ у межах одного і того ж морфологічного варіанта. Задача запропонованого "Способу цитогенетичної діагностики лімфопроліферативних процесів" - підвищення точності та ефективності диференційної цитоморфологічної діагностики доброякісних і злоякісних ЛПЗ методом цитогенетичного дослідження ядерного субстрату лімфоїдних клітин. Поставлена задача досягається таким чином: проводиться чітка кількісна і якісна оцінка основних морфофункціональних варіантів ядерець, які виявляються при світловій мікроскопії. У цитологічній діагностиці ЛПЗ подібний метод не застосовувався. Дослідження активних форм ядерець проведено на гістологічно верифікованому матеріалі 2-х груп хворих ЛПЗ: 20 хворих з різними морфологічними підтипами НХЛ і 12 хворих з доброякісними ЛПП (табл. 1, 2). Об'єктом цитологічного дослідження були пунктати лімфатичних вузлів, шкребки, відбитки з видалених лімфатичних вузлів різної локалізації. Всі лімфограми попередньо досліджувались забарвленими за методом Паппенгейма. Для візуалізації і подальшого вивчення ядерцевого апарату використовували методику імпрегнації сріблом ядерцеутворюючих регіонів хромосом в інтерфазних клітинах за методом W. Howell і D. Black [8] та модифіковану нами методику для вивчення архівних препаратів. У кожному спостереженні проводився диференційований підрахунок чотирьох основних морфофункціональних типів ядерець (компактних, нуклеолонемних, кільцевидних та мікроядерець) на основі класифікації вітчизняних авторів [7]. У 100 ядрах лімфоїдних клітин вивчали топографію АГ нуклеолонемних ядерець для визначення кількості активних ядерець перехідного типу - компактно-нуклеолонемних, для яких була характерна центрально-периферична топографія АГ різного розміру. Дослідження проводили світловим мікроскопіюванням за допомогою мікроскопа МБИ-15-2 при х900-, х1440кратному збільшенні імерсійної оптичної системи. Встановлено, що на відміну від доброякісних ЛПП в НХЛ представлений повний набір морфофункціональних типів ядерець, що виявляються при світловій мікроскопії, з появою у 100% спостережень типових ядерець компактного типу, що є объективною цитогенетичною особливістю НХЛ. Відсотковий вміст активних компактно нуклеолонемних типів ядерець при НХЛ становив від 68% до 90% (середній вміст - 82,2±3,3) в малігнізованих лімфоцитах, від 50% до 99,2% (середній вміст - 84,4±4,4) в малігнізованих пролімфоцитах, від 84% до 99,5% (середній вміст - 88,8±2,1) в малігнізованих бластних клітинах. У той час, коли при доброякісних гіперплазіях відсотковий вміст компактно-нуклеолонемних ядерець варіював від повної відсутності до 50% (середній вміст - 6,7±3,6) в лімфоцитах, до 60% (середній вміст - 11,7±5,3) в пролімфоцитах, до 78% (середній вміст - 17,6±7,1) в лімфобластах. Очевидно, що середній відсотковий вміст компактно-нуклеолонемних ядерець в малігнізованих лімфоїдних клітинах різного ступеня зрілості значно перевищує їх вміст в аналогічних клітинах при доброякісних ЛПП, що є об'єктивним, статистично вірогідним [9], диференційнодіагностичним цитогенетичним показником. Таким чином, вміст активних компактних і перехідних компактно-нуклеолонемних ядерець при НХЛ статистично вірогідно відрізняється від вмісту таких при доброякісних гіперплазіях. Технічний результат винаходу полягає у кількісній та якісній оцінці цитогенетичних показників лімфоїдних клітин різного ступеню зрілості для більш точної диференційної діагностики лімфаденопатій доброякісного і злоякісного характеру та проявляється наявністю у 100% спостережень при НХЛ типових активних ядерець компактного типу (від 0,10±0,004 до 0,39±0,002 - від 1,3% до 4,6%), при повній відсутності їх при доброякісних гіперплазіях; статистично вірогідно підвищеним відсотковим вмістом компактно-нуклеолонемних ядерець перехідного типу при НХЛ (від (82,2±3,3)% до (88,8±2,1)%) порівняно з доброякісними гіперплазіями (від (6,7±3,6)% до (17,6±7,0)%). Приклад конкретного використання 1 Хворий Бейер А. В., 1988 р. н., історія хвороби № 1231, який знаходився на обстеженні в Українському НДІОР з 10.10.1993 по 17.10.1993. Захворів місяць тому, коли було помічене збільшення лімфатичних вузлів шиї. Проведена відкрита біопсія лімфатичного вузла шиї, зроблені відбитки для цитологічного дослідження. Цитологічне заключення № 4944 від 11.10.1993: лімфоїдні елементи з ознаками проліферації. Патогістологічне заключення № 17448/93 p.: реактивна фолікулярна гіперплазія. Клінічний діагноз - той самий. Об'єктом цитологічного дослідження були відбитки з видалених лімфатичних вузлів шиї. Всі лімфограми попередньо досліджувались забарвленими за методом Паппенгейма. Для візуалізації і подальшого вивчення ядерцевого апарату використовували методику імпрегнації сріблом ядерцеутворюючих регіонів хромосом в інтерфазних клітинах за методом W. Howell і D. Black [8] та модифіковану нами методику для вивчення архівних препаратів. У кожному спостереженні проводився диференційований підрахунок чотирьох основних морфофункціональних типів ядерець (компактних, нуклеолонемних, кільцевидних та мікроядерець) на основі класифікації вітчизняних авторів [7]. У 100 ядрах лімфоїдних клітин вивчали топографію АГ нуклеолонемних ядерець для визначення кількості активних ядерець перехідного типу – компактно-нуклеолонемних, для яких була характерна центрально-периферична топографія АГ різного 2 40230 розміру. Дослідження проводили світловим мікроскопіюванням за допомогою мікроскопа МБИ-15-2 при х900-, х1440-кратному збільшенні імерсійної оптичної системи. Встановлено, що в ядрах проліферуючих лімфоїдних елементів різного ступеню зрілості представлений неповний набір основних морфофункціональних типів ядерець, що виявляються при світловій мікроскопії, - не визначаються типові ядерця компактного типу. Активні компактнонуклеолонемні типи ядерець відсутні в ядрах лімфоцитів і пролімфоцитів, в ядрах лімфобластів вони склали 8%, в той час, як власне нуклеолонемні ядерця з відносно рівномірним периферичним розподілом переважно середніх та дрібних АГ визначалися в 92%. Приклад конкретного використання 2 Хворий Бобелюк С.А., 1992 р. н., історія хвороби № 2675, який знаходився на обстеженні в Українському НДІОР з 6.05.1998 по 15.09.1998. Захворів 2 місяці тому, коли було помічене збільшення лімфатичних вузлів в області шиї, праворуч. Після звернення до лікаря дитину лікували з приводу лімфаденіту (антибіотики, сухе тепло) без ефекту. Після неодноразового обстеження та симптоматичного лікування за місцем проживання 10.04.1998 у хірургічному відділенні міської лікарні міста Тернополя провели оперативне видалення шийного лімфатичного вузла, патогістологічне та цитологічне дослідження якого не виявили онкозахворювання, і хворий був виписаний із стаціонару. Через 1 тиждень почався інтенсивний ріст пухлини і хворий був направлений на консультацію в УНДІОР. Дитину непокоїли болі в області шиї праворуч, що ірадіювали в вухо, зуби, голову, утруднене ковтання, дихання. В області шиї праворуч визначалась щільна бугриста пухлина, що займала область від сосковидного відростка до надключичної області. Шкіра над пухлиною – гіперемована. Консультативне цитологічне заключення № 404/6 пунктату шийного лімфатичного вузла: на фоні крові визначаються лімфоїдні елементи, переважно незрілі, а також нейтрофільні лейкоцити в помірній кількості - підозра на лімфосаркому. 7.05.1998 хворому знову проведена відкрита біопсія шийного лімфатичного вузла. Цитологічне заключення № 1393 від 7.05.1998 Інституту експериментальної патології онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України: в мазках-відбитках видалених при біопсії лімфатичних вузлів – мономорфна популяція лімфоїдних бластів з інтенсивно-базофільною вакуолізованою цитоплазмою (типу L3), поодинокі макрофаги. Заключення: неходжкінська злоякісна лімфома, дифузна, беркитоподібна (НЗЛ L3). Цитологічне заключення № 1861 від 8.05.1998 за матеріалом відбитків видаленого лімфатичного вузла: злоякісна неходжкінська лімфома, лімфобластна, високого ступеня злоякісності (L2 за FAB-класифікацією). Патогістологічне заключения № 6940/1 від 19.05.1998: злоякісна лімфома, лімфобластна лімфосаркома з осередками беркитоподібної будови, дифузного характеру росту, з інфільтрацією прилеглої м'язової та жирової тканини. Заключний клінічний діагноз: лімфосаркома шиї праворуч, стадія 2, клінічна група 2. Цитогенетичне дослідження. Об'єктом цитогенетичного дослідження були відбитки з видаленого лімфатичного вузла шиї. Лімфограми попередньо досліджувались забарвленими за методом Паппенгейма. Для візуалізації і подальшого вивчення ядерцевого апарату використовували методику імпрегнації сріблом ядерцеутворюючих регіонів хромосом в інтерфазних клітинах за методом W. Howell і D. Black [8]. Проводився диференційний підрахунок чотирьох основних морфофункціональних типів ядерець (компактних, нуклеолонемних, кільцевидних та мікроядерець) на основі класифікації вітчизняних авторів [7]. У 100 ядрах лімфоїдних клітин вивчали топографію АГ нуклеолонемних ядерець для визначення кількості активних ядерець перехідного типу – компактно-нуклеолонемних, для яких була характерна центрально-периферична топографія АГ різного розміру. Дослідження проводили світловим мікроскопіюванням за допомогою мікроскопа МБИ-15-2 при х900-, х1440-кратному збільшенні імерсійної оптичної системи. Встановлено, що в ядрах малігнізованих лімфобластів представлений повний набір морфофункціональних типів ядерець, що виявляються при світловій мікроскопії, з появою типових ядерець компактного типу (0,48±0,10 - 5,5%). Відсотковий вміст активних компактно-нуклеолонемних типів ядерець склав 88,5%. Дані цитогенетичного дослідження свідчать про злоякісний лімфопроліферативний процес. Порівняння цитогенетичних даних хворих Бобелюк С.А., Бейер А. В. виявило суттєві відмінності у вмісті активних компактних і компактнонуклеолонемних типів ядерець. Це дозволило з більшою точністю провести диференційну діагностику ЛПЗ, визначити характер патологічного процесу, що має суттєве значення для тактики лікування та ймовірного клінічного прогнозу. Виявлені особливості прояву ЯОР ядер лімфоїдних клітин при НХЛ та доброякісних гіперплазіях можуть бути застосовані в якості об'єктивних цитогенетичних критеріїв та дозволять розширити можливості диференційної цитологічної діагностики ЛПЗ на рівні світлової мікроскопії. Джерела інформації 1. Лебедева Н.Б., Меркулова И.Б., Гаврилова Т.Н., Зубрихина Г.Н. Ядрышкообразующие районы лимфоидных элементов костного мозга и периферической крови у больных неходжкинскими лимфомами в стадии лейкемизации // Клиническая лабораторная диагностика. - 1997. - № 5. С. 65. 2. Райхлин Н.Т., Букаева И.А., Пробатова Н.А., Смирнова Е.А., Тупицин Н.Н., Шолохова Е.Н. Ядрышковый организатор как маркер степени злокачественности и прогноза неходжкинских злокачественных лимфом // Архив патологии. 1996. - Т. 58. - № 4. - С. 22-27. 3. Букаева А.И., Райхлин Н.Т., Пробатова Н.А., Смирнова Е.А., Тупицин Н.Н., Шолохова Е.Н. Дифференциально-диагностическое и прогностическое значение активности области ядрышковых организаторов при неходжкинских злокачественных лимфомах // Клиническая лабораторная диагностика. - 1997. - № 10. - С. З7-38. 3 40230 4. Ploton D., Menager M., Jeanneson P. Improvement in the staining and in the visualisation of the argyrophilic proteins of nucleolar organizer regions at the optical level // HistochemJ, 1986, vol. 18, p. 5-14. 5. Дубенская Л.И., Баженов С.М. Белки, ассоциированные с зонами ядрышкового организатора: практическое применение в онкоморфологии и связь с биологическими особенностями опухоли // Архив патологии. - 1992. - Т. 54. - № 4. - С. 40-43. 6. Дубровский А.Ч., Клюкина Л.Б. Зоны организаторов ядрышка и митотическая активность не ходжкинских лимфом // Архив патологии. - 1997. Т. 59. - № 1. - С. 25-30 (прототип). 7. Челидзе П.В., Зацепина О.В. Морфофункциональная классификация ядрышек // Успехи современной биологии. - 1988. - Т. 105. - № 2. С. 252-266. 8. Howell W., Black D. Controlled silver staining of nucleolus organizer regions with protectiv colloidal developer // Experientia, 1980, vol. 36, p. 1014-1015. 9. Стрелков Р.Б. Статистические таблицы для экспресс-обработки экспериментального и клинического материала. - 1990. - 17с. Таблиця 1 Відсоткове співвідношення топографії аргентофільних гранул нуклеолонемних ядерець в злоякісних неходжкінських лімфомах Типи малігнізованих лімфоїдних клітин Лімфоцити Пролімфоцити Лімфобласти п* п+ц** П п+ц п п+ц Лімфоцитарна лімфома 17 83 16 84 22 78 Лімфоцитарно-пролімфоцитарна, дифузна 12 88 12 88 10 90 11 89 16 84 13 87 16 84 17 83 Пролімфоцитарна лімфома 11 89 Пролімфоцитарна лімфома, дифузна 13,4 86,6 0,8 99,2 10 90 32 68 Бластні форми неходжкінських лімфом Імунобластна лімфома 10 90 Лімсфобластна лімфома, дифузна 16 84 16 84 Лімфобластна лімфома 0,5 99,5 11,5 88,5 14 86 10 90 Неходжкінські лімфоми без визначення морфологічного підтипу 32 68 50 50 3 97 17 83 № п/п Прізвище хворого 1 Б-ко 2 3 4 5 Ц-ка Л-рь К-ко Щ-на 6 Н-ков 7 8 9 10 С-ка С-ко С-в К-к 11 К-ша 12 13 Г-ша Я-к 14 15 16 17 Б-л Б-к Кож-к Х-н 18 19 20 Ков-к С-на І-ко Середній вміст 17,8±3,3 32-10 82,2±3,3 90-60 16,0±4,4 50-0,8 84,0±4,4 99,2-50 11,2±2,1 18-0,5 п* - периферичний розподіл аргентофільних гранул. п+ц** - поєднання периферичного і центрального розміщення аргентофільних гранул. 4 88,8±2,1 99,5-82 40230 Таблиця 2 Відсоткове співвідношення топографії аргентофільних гранул нуклеолонемних ядерець при доброякісних гіперплазіях Типи лімфоїдних клітин лімфоцити Пролімфоцити лімфобласти п* п+ц* П п+ц п п+ц Лімфоїдна гіперплазія 1 В-ко 100 100 100 Гіперплазія лімфатичного вузла 2 П-ва 100 80 20 90 10 Реактивна фолікулярна гіперплазія 3 Б-р 100 100 92 8 Лімфопроліферативний процес 4 Н-ра 100 100 100 Хронічний лімфаденіт 5 Ю-ва 100 100 100 Хронічний гіперпластичний лімфаденіт 6 П-в 100 99 1 83 17 Хронічний гіперпластичний лімфаденіт з осередками абсцедування 7 М-к 50 50*** 40 60*** 80 20*** Хронічний лімфаденіт 8 К-ль 78 22*** 100 100 Хронічний гіперпластичний процес 9 Ко-ль 100 100 100 Продуктивний туберкульозний лімфаденіт 10 Ка-бе 100 100 50 50*** Продуктивний лімфаденіт 11 Г-ц 100 100 Гранульоматозний епітеліоїдноклітинний лімфаденіт з наявністю багатоядерних клітин типу Пирогова- Лангханса 12 Ч-ль 91 9 40 60 22 78*** 93,2±4,5 6,7±3,6 88,3±5,4 11,7±5,3 82,4±7,0 17,6±7,0 Средній вміст 100-50 50-9 100-40 60-1 100-22 78-8 № п/п Прізвище хворого п* - периферичний розподіл аргентофільних гранул. п+ц** - поєднання периферичного і центрального розміщення аргентофільних гранул. *** - поодинокі середні та пилеподібні гранули в центрі нуклеолонемних типів ядерець. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 5