Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб кількісного визначення загального IgM людини, в основі якого лежить високочутлива та специфічна імунохімічна реакція, який відрізняється тим, що використовують неконкурентний «сендвіч»-варіант імуноферментного аналізу на основі моноклональних антитіл до IgM людини епітопів А та В, а також має границю чутливості 11 нг/мл.

Текст

Реферат: UA 67778 U UA 67778 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до імунохімії, біохімії та біотехнології, і може бути використана для кількісного визначення загального IgM людини у біологічних рідинах організму та культуральних рідинах. Найчастіше концентрацію імуноглобулінів визначають методами нефелометрії чи турбідиметрії [1, 2]. Однак ці методи недостатньо чутливі для контролю продукції й визначення рівня секреції імуноглобулінів В-клітинами, наприклад, у культурі лімфоцитів з метою диференціального діагнозу первинних імунодефіцитів або оцінки ступеня вторинних імунодефіцитів, обумовлених низьким рівнем антитіл. Імуноферментний метод характеризується високою чутливістю, яка й необхідна для таких діагностичних завдань. Таким чином, перед нами постало завдання по розробці високочутливого імуноферментного аналізу (ІФА). Найбільш близьким по технічній суті до пропонованого є спосіб визначення IgM в реакції аглютинації з використанням антитіл до IgM, сорбованих на поверхні полістиролових мікропланшет [3]. Однак при багатоетапності способу він дозволяє виявляти лише специфічні IgM, що обмежує можливості його використання для визначення гуморального статусу організму. У порівнянні із іншими підходами запропонований нами спосіб кількісного визначення загального IgM людини передбачає використання неконкурентного "сендвіч"-варіанту імуноферментного аналізу на базі моноклональних антитіл (МКАТ) до IgM людини епітопів А та В [4]. В основу корисної моделі поставлено задачу: високоефективний та відтворюваний спосіб кількісного визначення загального IgM людини у біологічних рідинах організму та культуральних рідинах. Задачу вирішували шляхом використання високочутливого неконкурентного "сендвіч" варіанту імуноферментного аналізу, у якому як антитіла захоплення використовують моноклональні антитіла до IgM людини епітопів А та В. Запропонований спосіб характеризувався високою чутливістю (11 нг/мл) та специфічністю, а також задовільними показниками варіабельності аналізу. Приклад 1. Розробка імуноферментного аналізу для кількісного визначення загального IgM людини. Розробку ІФА починали із підбору пари МКАТ для так званої IgM-"пастки" (модифікація ІФА). За даними епітопного картування А та В МКАТ розпізнають найбільш віддалені епітопи. За результатами вивчення властивостей МКАТ у ІФА для визначення специфічних IgM антитіла епітопу А1 (111С2, 112С5.2) та епітопу В1 (125В5, 126G6) засвідчили кращі результати при використанні у складі імуносорбенту, а епітопу А2 (112Н12, 116С4) та епітопу В2 (125С5) - у складі імуноферментного кон'югату [4]. МКАТ епітопів А1-В2 та В1-А2 являють собою найбільш вірогідну "сендвіч"-комбінацію для конструювання неконкурентного ІФА. Для встановлення оптимальної орієнтації МКАТ у тест-системі антитіла епітопів А1, В1 тестувалися у вигляді імуносорбенту, а епітопів А2, В2 у вигляді пероксидазних кон'югатів (табл. 1). Сорбційнодетекційна здатність різних пар МКАТ корелювала із їх афінністю, й була максимально вираженою для високоафінних моноклональних антитіл 125В5 і 112Н12. Дана пара МКАТ використовувалася для подальших досліджень. Після встановлення оптимальної конфігурації МКАТ у "сендвіч"-ІФА, проводилася оптимізація умов постановки аналізу: встановлення робочих концентрацій моноклональних антитіл та імуноферментного кон'югату, часу та умов постановки, об'єму зразка та складу реакційного буфера. 1 UA 67778 U Таблиця 1 Ефективність визначення IgM моноклональними антитілами різних епітопів у "сендвіч"-варіанті ІФА Кон'югат Сорбція Епітопи і МКАТ А1 В1 112С2 112С5.2 125В5 126G6 Епітопи і МКАТ В2 125С2 1,644 1,533 0,882 0,230 А2 112Н12 1,152 1,093 1,832 1,742 116С4 0,512 0,215 1,645 1,604 Примітка. У таблиці наведено середні значення оптичної густини при постановці ІФА із зразком IgM (20 нг/мл) у чотирьох повторностях; р2,5) (див. креслення). На кресленні зображена стандартна крива "сендвіч"-ІФА (-●-) й рівень варіабельності визначення стандартних концентрацій IgM в одній постановці (Intra-CV; - -) та між постановками (Inter-CV;-▲-). Таким чином, динамічний діапазон склав 2 порядки (11-3200 нг/мл). Такий динамічний діапазон вимагає попереднього розведення сироватки/плазми крові та інших біологічних рідин при постановці аналізу. На рівні стандартів IgM тест-система засвідчила допустимі показники варіабельності, виходячи із величини коефіцієнтів варіації в рамках однієї постановки (intra-CV=4,8±2,0 %) й між постановками (inter-CV=5,3±2,2 %). Значення intra-CV та inter-CV стабілізуються у середньому діапазоні концентрацій IgM (20-320 нг/мл) та дещо завищені в районі крайових концентрацій імуноглобуліну (0-20 нг/мл), що вказує на найбільшу роздільну здатність тесту при визначенні концентрацій IgM, починаючи із 20 нг/мл. Визначення концентрацій IgM вище 320 нг/мл характеризується максимальною стабільністю (intra-CV=0,6 %, inter-CV=2,1 %), що додатково свідчить про те, що верхнє обмеження динамічного діапазону у розробленому ІФА не пов'язано із насиченням ділянок зв'язування МКАТ, а обумовлено можливостями фотометричного методу детекції. 2 UA 67778 U 5 10 Як відомо перехресна реактивність одного або двох МКАТ, на основі яких розроблено ІФА, із структурно близькими із IgM білками боже бути причиною хибнонегативних або хибнопозитивних результатів, відповідно. Для встановлення факту перехресної реактивності імуноглобуліни інших класів (IgG, IgA, IgE людини) та альбумін у концентрації 1 мкг/мл додавали до реакційної суміші ІФА із відомою концентрацією IgM (100 нг/мл) та їх ефект визначали як ефективність визначення (%) відомої концентрації IgM людини (різниця результатів визначення концентрації IgM зразків із концентрацією 100 та 0 нг/мл, що приведена у відсотках). Як свідчать дані таблиці 2, жоден із досліджуваних білків сироватки не впливав на визначення тест-концентрації IgM людини. Таким чином, розроблений "сендвіч"-ІФА не виявляв перехресної реактивності із іншими білками сироватки. Таблиця 2 Перехресна реактивність "сендвіч"-ІФА із білками сироватки крові людини Білок (1 мкг/мл) IgG, людини IgA людини IgE людини Альбумін IgM 0 нг/мл 0 0 0 0 100 нг/мл 100,1 102,1 100,5 100,2 Виявлення, % 100,1 102,1 100,5 100,2 Примітка. У таблиці наведено середні значення визначення концентрації IgM при постановці ІФА у присутності інших білків у шести повторностях; р

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Method for quantitative determination of total human igm

Автори англійською

KYIV POLYTECHNIC INSTITUTE", NATIONAL TECHNICAL UNIVERSITY OF UKRAINE

Назва патенту російською

Способ количественного определения общего igm человека

Автори російською

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ УКРАИНЫ "КИЕВСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ"

МПК / Мітки

МПК: C12N 5/00

Мітки: визначення, людини, кількісного, спосіб, загального

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/6-67778-sposib-kilkisnogo-viznachennya-zagalnogo-igm-lyudini.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб кількісного визначення загального igm людини</a>

Подібні патенти