Ветеринарний біопрепарат

1. Ветеринарний біопрепарат, що містить біомасу ентеробактерій Escherichia coli штамів Г35 №1-413, Г35 №2-412 і Г35 №3-411, біомасу бактерій штаму Enterococcus faecalis Г35 №4-410 та захисне середовище, який відрізняється тим, що 3 живих мікробних клітин в 1 мл фізіологічного розчину Біомаса Escherichia coli Г-2-601·108-1·109 живих мікробних клітин в 1 мл фізіологі- 18-19 чного розчину Біомаса Escherichia coli Г-3-611·108-1·109 живих мікробних клітин в 1 мл фізіологі- 18-19 чного розчину Біомаса Streptococcus faecalis Г-4621·108-1·109 живих мікробних клітин в 1 36-38 мл фізіологічного розчину Наповнювач (захисне середовище) 10-5 [Пат. Укр. №21979, МПК: А61 К 35/66, Бюл. №2 від 30.04.98]. Спосіб одержання відомого біопрепарату включає приготування суспензії мікробних культур роздільним культивуванням штамів, що входять до складу біопрепарату, на поживних середовищах при 37°С з подальшим змивом колоній бактерій фізіологічним розчином та змішуванням біомас штамів бактерій Escherichia coli Г-1-59, Escherichia coli Г-2-60, Escherichia coli Г-3-61 та Streptococcus faecalis Г-4-62 у співвідношенні, що дорівнює 1:1:1:2 відповідно. В отриману суспензію вводять наповнювач для захисту бактеріальних клітин та ліофільно висушують із отриманням біопрепарату у формі бактеріального концентрату. Авторами винаходу за патентом №21979 показана висока ефективність відомого біопрепарату при лікуванні гострих кишкових інфекцій різної етіології у дітей і дорослих та ліквідації стану дисбактеріозу, відзначена резистентність препарату до широкого спектру антибіотиків. Однак, умови застосування відомого біопрепарату для лікування шлунково-кишкових захворювань тварин не розглянуті та ефективність його для цих організмів експериментально не підтверджена. Завданням корисної моделі, що заявляється, є створення на основі поєднання представників аеробної частини нормофлори людини - бактерій Escherichia coli і Enterococcus (Streptococcus) faecalis ефективного ветеринарного пробіотику для профілактики і лікування гастроентеритів молодняку свійських тварин, що дозволить розширити асортимент такого роду засобів, використання яких здатне гарантувати підвищення стійкості тварин до хвороб у перші місяці їх життя і, тим самим, знизити ризик втрати поголів'я. Поставлене завдання вирішено створенням нового ефективного для профілактики та лікування гастроентеритів молодняку тварин і птиці біопрепарату, який містить біомасу живих клітин ентеробактерій Escherichia coli штамів Г35 №1-413, Г35 №2-412 і Г35 №3-411, біомасу бактерій штаму Enterococcus faecalis Г35 №4-410 та захисне середовище і відрізняється від відомого біопрепарату тим, що він містить зазначені компоненти у такому співвідношенні, об. %: Біомаса Escherichia coli, що містить порівну клітини штамів Е. coli Г35 №1413,Е. coli Г35 №2-412 і Е. coli Г35 №3- 11-13 411у загальній кількості (1,0-2,0)·109 кл в 1 см3 середовища культивування Біомаса Enterococcus faecalis Г35 №4- 11-13 43647 4 Захисне середовище до 100 У складі біопрепарату, що заявляється, використані відомі штами бактерій, які були виділені із калових випорожнень умовно здорових людей у 1977 році Карапетяном О.Г. та задепоновані в Державному науково-дослідному інституті стандартизації та контролю медичних біологічних препаратів ім. Л.А. Тарасевича (м. Москва) під номерами: штами Escherichia coli Г-1-59, Г-2-60 і Г-3-61, а штам Streptococcus faecalis - Г-4-62. Ідентифікація вказаних штамів була підтверджена в Центральній санітарно-епідеміологічній станції МОЗ України та у 2007 році вони були первісно задепоновані в Депозитарії Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів під наступними номерами: штами Escherichia coli Г35 №1-413, Г35 №2-412, Г35 №3-411 і штам Enterococcus faecalis - Г35 №4-410 відповідно. Використовуючи 4 вищеназваних штами живих мікроорганізмів у винайденому співвідношенні їх біомас (1:1:1:3), створено новий біопрепарат, який пропонується застосовувати як ветеринарний пробіотик. Біопрепарат, що заявляється, містить 74-78 % захисного середовища. Як захисне середовище може бути застосований обрат молока з додаванням сахарози (16-20 %) та желатину (12-15 %). Завдяки вмісту в складі пропонованого біопрепарату сахарозо-желатиново-молочної суміші, яка захищає бактеріальні клітини під час ліофілізації, він може бути виготовлений та застосований у формі сухого порошку. Наведені нижче (приклад 2) дані щодо результатів досліджень стану піддослідних тварин після приймання біопрепарату, що заявляється, свідчать про зміни у кращий бік стану кишкової мікрофлори та підтверджують його високу терапевтичну ефективність як ветеринарного пробіотику, що сприяє нормалізації кишкового мікробіоценозу та усуненню кишкових розладів у молодняка тварин. Результати проведених комісійних випробувань показують також, що приймання нового біопрепарату сприяє значному покращенню клінічних показників життєдіяльності тварин: збільшенню добового приросту маси тіла та підвищенню збереженості поголів'я молодняку свійських тварин та птиці (приклади 3, 4). Таким чином, поставлене завдання корисної моделі виконано з досягненням необхідного технічного результату. Спосіб одержання пропонованого біопрепарату включає: - посів кожного штаму бактерій на чашки Петрі з м'ясо-пептонним агаром та термостатування при 37 °С протягом 24 годин з наступним змиванням колоній бактерій з поверхні чашок фізіологічним розчином або пептонно-сольовим розчином; - підрощування кожного штаму окремо у рідкому поживному середовищі протягом 8-12 годин при 37 °С; для синхронізації приросту біомас співвідношення об'єму інокуляту та середовища для кожного штаму Escherichia coli складає 1:10, а для штаму Enterococcus faecalis - 2:10 відповідно. 5 - одержання біомаси виробничих штамів, для чого підрощений інокулят кожного штаму Escherichia coli з приблизно однаковою кількістю клітин вносять в один ферментер для спільного культивування, а інокулят штаму Enterococcus faecalis - у другий ферментер; після термостатування при 37 °С протягом 18-24 годин отримують біомасу 3-х штамів бактерій Escherichia coli, що містить загалом (1,0-2,0)·109 кл/см3 (при однаковій кількості клітин кожного штаму в суміші), та біомасу штаму Enterococcus faecalis з вмістом мікроорганізмів - (1,0-2,0)·109кл/см3; - змішування одержаних біомас штамів у співвідношенні 1:1 та додавання 74-78 об. % захисного середовища; - розлив суміші у стерильні скляні флакони або лотки, ліофільне висушування та фасування одержаного бактеріального концентрату. 1 г сухого ліофілізованого біопрепарату містить не менш ніж 2,0·108 клітин мікроорганізмів. Нижче наведено приклад одержання біопрепарату, що заявляється, (приклад 1) та приклади його застосування як ефективного ветеринарного пробіотику для профілактики і лікування шлунковокишкових захворювань молодняку свійських тварин та птиці (приклади 2, 3 та 4). Приклад 1. За описаною вище технологією, згідно з винаходом, що заявляється, готують біопрепарат, який містить в об. %: Біомасу Escherichia coli штамів Е. соlі Г35 №1-413,Е. coli Г35 №2-412 і Е. coli Г35 №3-411 (співвідношення штамів 12,5 1:1:1) у загальній кількості не менш 9 3 ніж 1,0·10 кл в 1 см середовища культивування Біомасу Enterococcus faecalis Г35 №4410 у кількості не менш ніж 1,0·109 кл 12,5 в 1 см3 середовища культивування Сахарозо-желатиново-молочне захи75 сне середовище Застосовують захисне середовище на основі знежиреного молока (обрату) з додаванням 16 % сахарози та 13 % желатини. Отриманий біопрепарат містить не менш ніж 2,5·108 клітин бактерій в 1 см3 рідини, що складається з компонентів середовища культивування та захисного середовища. Для отримання біопрепарату в ліофілізованій формі суспензію розливають у флакони або лотки, заморожують за температури мінус 40-45 °С і ліофілізують у вакуум-сушильному апараті. Ліофілізований біопрепарат - розсипчастий порошок білого або кремового кольору, що містить в 1 г не менш ніж 2·108 клітин мікроорганізмів (не менш ніж 100 млн клітин 3-х штамів Escherichia coli і 100 млн клітин штаму Enterococcus faecalis). Його фасують у стерильні флакони або пакети, враховуючи рекомендовану кількість споживання пробіотичних мікроорганізмів за добу, але із розрахунку не менш ніж 107 клітин (0,1 г) в 1 дозі препарату. Приклад 2. Для оцінки дії нового біопрепарату на кишкову мікрофлору молодняка тварин проводили випробування зразка препарату, одержаного за прикла 43647 6 дом 1, в умовах ДП «Дослідне господарство «Прогрес»» Чернігівського інституту АПВ УААН на 2-х групах тварин: - 1 група: 20 телят віком 1-2 місяці; - 2 група: 20 поросят віком 3-4 місяці. Кожна група тварин була поділена на 2 підгрупи: контрольну та дослідну, по 10 тварин у кожній. Тварини контрольних підгруп знаходилися на звичайному раціоні, а піддослідні тварини додатково до раціону одержували отриманий за прикладом 1 ліофілізований біопрепарат. Телята отримували біопрепарат 1 раз на добу протягом 3 діб у дозі 1,2 г на голову. Препарат попередньо розчиняли в 150 см3 кип'яченої та охолодженої до 40 °С води та давали тваринам під час випоювання з молоком. Поросята отримували препарат також 1 раз на добу протягом 3 діб у дозі 0,6 г на голову. Препарат після розчинення у 100 см3 теплої (40 °С) кип'яченої води давали поросятам у суміші з комбікормом. Спостереження за станом тварин та необхідні аналізи виконували протягом 15 діб. Для оцінки стану кишкової мікрофлори проводили визначення патогенних і умовно-патогенних видів мікроорганізмів у калітварин на початку експерименту (1-й день) та через 11 днів після останнього прийому препарату (15-й день експерименту) за відомою методикою: шляхом послідовних розведень аналізованих зразків з наступним посівом їх на диференційні поживні середовища [Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. - М.: «Медицина», 1978. - 394с.]. Результати аналізів наведені у таблиці 1. Наведені у таблиці 1 дані обстеження поросят і телят показують, що на початку експерименту у тварин усіх підгруп (як контрольних так і дослідних) у складі мікрофлори були присутні умовнопатогенні і патогенні мікроорганізми: Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Proteus vulgaris. Зазвичай такі мікроби присутні у неякісних кормах та свідчать про наявність захворювань шлунковокишкового тракту тварин. Посів на 15 день спостережень свідчить про збереження у тварин контрольних підгруп негативної картини, яку виявлено на початку експерименту. У той же час у тварин дослідних підгруп, що приймали біопрепарат, умовно-патогенна мікрофлора не висівалась і титр Е. соlі залишався у межах норми, тобто спостерігалась нормалізація мікрофлори піддослідних тварин. Зовнішній огляд тварин як контрольних, так і дослідних підгруп на початку досліджень засвідчив їх пригнічений стан, малу рухливість, ознаки дистрофії, прояви кишкових розладів (діарейний синдром). На 15-й день досліджень стан тварин контрольних підгруп не змінився, в той час як у тварин, які приймали біопрепарат, не було виявлено кишкових розладів; тварини дослідних підгруп відрізнялись від тварин контрольних підгруп кращим апетитом і більшою рухливістю. Отримані результати підтверджують ефективність застосування пропонованого біопрепарату як ветеринарного пробіотику. Приклад 3. 7 В умовах ДП «Дослідне господарство «Прогрес»» Чернігівського інституту АПВ УААН досліджували також вплив застосування біопрепарату, що заявляється, на клінічні показники сільськогосподарських тварин у перші місяці їх життя. Дослідження проводили на 2-х групах тварин: - 1 група: 20 поросят віком 1-2 місяці; - 2 група: 10 телят віком 1-2 місяці. Кожна група включала контрольну та дослідну підгрупи з рівною кількістю тварин у підгрупах. Тварини контрольних підгруп перебували на традиційному раціоні харчування, а тварини дослідних підгруп отримували додатково до звичайного раціону 1 раз на добу протягом 3 днів біопрепарат, одержаний за прикладом 1. Поросятам давали препарат в суміші з комбікормом (при умові рівномірного змішування) у дозі 0,6 г пробіотику на 1 голову, а телятам - при випоюванні з молоком (за умов рівномірного змішування) в кількості 1,2 г пробіотику на 1 голову. У контрольних та дослідних підгрупах оцінювали стан тварин на початку експерименту (1-й день) та через 11 днів після останнього прийому препарату (14-й день). Аналіз зовнішніх ознак стану та поведінки тварин показав, що на початку досліджень у всіх тварин (як і у прикладі 2) спостерігався пригнічений стан, ознаки дистрофії, прояви діарейного синдрому. На 14-й день досліджень стан тварин контрольних підгруп не змінився, а у тварин дослідних підгруп кишкових розладів не було виявлено, вони також відрізнялись від тварин контрольних підгруп кращим апетитом і більшою рухливістю. Дані про клінічні показники піддослідних тварин, які наведено у табл. 2, 3, свідчать про те, що приймання біопрепарату не тільки покращило показники середньодобового приросту тварин, але й забезпечило повну схоронність поголів'я телят, в той час як 40 % телят, що не одержували біопрепарат, загинуло. Приклад 4. Вивчали ефективність пропонованого біопрепарату для профілактики захворювань та збереження поголів'я молодняку птиці. Об'єктом випробувань слугували добові курчата породи «Ломенбраув»: контрольна група курчат - 20 голів - перебувала на звичайному раціоні, до складу якого входили суміш у рівних кількостях кукуру 43647 8 дзяної крупи та повноцінного збалансованого гранульованого комбікорму для курчат ПК-2-6, що не містить гормонів та штучних стимуляторів росту; кип'ячена вода. Перша дослідна група курчат - 20 голів - окрім звичайного раціону додатково отримувала кожен день протягом трьох днів лікувальну дозу (0,2 г) біопрепарату за прикладом 1, який попередньо розводили у 50 см3 кип'яченої води, охолодженої до 40 °С. Для вивчення токсичної дії біопрепарату курчата другої дослідної групи (20 курчат) отримували біопрепарат із розрахунку 1 г на 20 курчат на добу, тобто десятикратну дозу, порівняно з профілактичною дозою, яка складає 0,1 г препарату для 20 курчат на добу. Обидві дослідні та контрольна групи курчат перебували в однакових умовах утримання. Щоденні спостереження за курчатами всіх груп виявили, що курчата дослідних груп під час та після закінчення курсу прийому препарату відрізнялися більшою рухливістю, кращим апетитом та якістю пуху порівняно з контрольною групою. Збереженість поголів'я на наступний день після закінчення прийому препарату (4-й день досліджень) склала 90 % в обох дослідних групах та 85 % у контрольній. Збереженість поголів'я на 7-й день після припинення прийому препарату (10-й день досліджень) в дослідних групах склала 85 %, а у контрольній групі – 80 %. Середньодобовий приріст маси тіла курчат контрольної групи під час проведення експерименту склав 0,76 г, а середньодобовий приріст маси тіла курчат дослідних груп був на 20 % більшим. Проведені дослідження свідчать про те, що пропонований біопрепарат не є токсичним, а його застосування способом, що заявляється, сприяє значному покращенню показників життєдіяльності, збільшенню приросту маси тіла та схоронності поголів'я молодняку птиці. Таким чином, наведені результати випробувань свідчать про виражену терапевтичну та імунопротекторну дію на організм молодняку сільськогосподарських тварин та птиці нового пробіотику та ефективність його застосування для профілактики та лікування шлунково-кишкових захворювань тварин. 9 43647 10 Таблиця 1. Кількість КУО в 1г фекалій 1 день Групи тварин 7 15 день E.coli (6,0×108) 8 Е.соlі (8,8·10 -6,0·10 ) Неферментуючі мікроорганізми (1,0×105) Citrobacter freundii (4,8×105) Enterobacter aerogenes (1,0×105) Proteus vulgaris (>1,0×106) Контрольна підгрупа Телята E.coli (8,8·107-6,0·108) Неферментуючі мікроорганізми (1,0х106) Citrobacter freundii (2,0х104) Enterobacter aerogenes (4,0×106) Proteus vulgaris (>1,0×106) E. coli (1,0×106-5,0×107) Неферментуючі мікроорганізми (1,0×105) Citrobacter freundii (4,8×105) Enterobacter aerogenes (4,0×106) Proteus vulgaris (>1,0×106) E.coli (1,0×106-5,0×107) Неферментуючі мікроорганізми (1,0×105) Citrobacter freundii (4,8×105) Enterobacter aerogenes (4,0×106) Proteus vulgaris (>1,0×106) Дослідна підгрупа Контрольна підгрупа Поросята Дослідна підгрупа Неферментуючі мікроорганізми (3,9×105) Citrobacter freundii (3,8×105) E. coli (1,0×108) E. coli (6,0×107) Неферментуючі мікроорганізми (4,0×105) E. coli (1,5×108) Таблиця 2. Поросята контрольна підгрупа Клінічні показники Жива маса, кг Середньодобовий приріст: кг, % Показники загибелі тварин: од. % дослідна підгрупа 1 день (початок ) 8,86±0,63 14 день 10,14±0,51 1 день (початок ) 10,14±1,01 14 день 13,44±0,91 0,098 1,12 0,098 0,98 0,098 0,98 0,254 2,50 0 0 0 0 0 0 0 0 Таблиця 3. Телята Клінічні показники Жива маса, кг Середньодобовий приріст: кг, % Показники загибелі тварин: од. % контрольна підгрупа 1 день (початок) 14 день 33,00±1,67 37,33±3,53 Комп’ютерна верстка І.Скворцова дослідна підгрупа 1 день (початок) 14 день 32,80±2,63 38,91±0,74 0,33 1,00 0,33 0,88 0,33 1,01 0,47 1,43 0 0 2 40 0 0 0 0 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601