Спосіб інтегральної оцінки біологічної відповіді на стан водного середовища

Спосіб інтегральної оцінки біологічної відповіді на стан водного середовища, який включає біоло 3 чинників, але і від швидкості протеолізу модифікованих білків. - відсутність гнучких критеріїв оцінки біологічної відповіді. Відомо, що за перевищення адаптивних можливостей організму, значення окремих показників, у тому числі і ступеня окиснення білків сироватки крові риб, можуть відповідати нормі; - використання як індикаторного організму риби, яка не є стаціонарним для певної ділянки водойми організмом, а тому не може бути використана для її характеристики; - процедура відбору крові у риб в токсичному середовищі не завжди є успішною. В основу корисної моделі поставлено задачу забезпечення активного біомоніторингу забруднення водойм шляхом створення способу адекватної і чутливої оцінки біологічної відповіді організму молюска на підставі кількісної оцінки характеристик оксидативного стресу шляхом обчислення інтегрального показника Індексу антиоксидантного стану (ІАС) на основі мінімального набору характеристик активності антиоксидантних факторів та інтенсивності прооксидантних проявів в тканині молюска з умовно чистої (контроль) і досліджуваної ділянки водойм та порівняння результатів. Поставлена задача вирішується тим, що на основі визначення трьох індивідуальних біохімічних показників у тканині травної залози молюска обчислюють Індекс антиоксидантного стану (ІАС) тканин як відношення сум показників стану антиоксидантних факторів (А) і прооксидантних проявів (П) після уніфікації показників. До "А" відносять активність супероксидисмутази (СОД) і каталази (КАТ), до "П" - утворення малонового діальдегіду (МДА). Відповідь організму в досліджуваній ділянці класифікується як стан адекватної відповіді, тривоги (оксидативний стрес), або виснаження захисних систем. Молюски є пасивними фільтраторами води та стаціонарними мешканцями водойм з великим географічним ареалом поширення. їх молекулярні системи антистресорного захисту високоіндуцибельні і чутливо реагують на якість водного оточення. Головними ферментами антиоксидантного захисту є супероксиддисмутаза та каталаза, які знешкоджують активні форми кисню, що генеруються у клітинах при дії забруднювачів різноманітного походження. При недостатній активності цих чинників відбувається ураження клітинних структур, в першу чергу мембранних ліпідів з утворенням продуктів перекисного окиснення, з яких МДА є одним із кінцевих (оксидативний стрес або стан тривоги), що служить сигналом для активації чинників антиоксидантного захисту і відтворення рівноваги «антиоксидантні чинники - прооксидантні прояви» (стан адекватної відповіді). При виснаженні можливостей антиоксидантного захисту прооксидантні прояви переважають (виснаження захисних систем), що є ознакою значного тривалого забруднення. Для використання способу одержують по 6 молюсків одного виду з подібними морфологічними показниками (розмір, вік, маса) із двох природних популяцій та визначають показники оксидати 45298 4 вного стресу в їх травній залозі або об'єднаних м'яких тканинах (за малих розмірів особин індикаторного виду). Для цього виготовляють 10%-ний (w/v) гомогенат тканини в 50мМ К-фосфатному буферному розчині, рН7,4, використовуючи електричний гомогенізатор Поттера з тефлоновим пестиком. Гомогенат центрифугують протягом 10хв при 6тис об./хв при охолодженні. Активність супероксиддисмутази вимірюють за зниженням швидкості відновлення нітротетразолію синього (НТЗС) в присутності феназинметасульфату і НАДН. Для визначення використовують 1мл 10% гомогенату тканини. До нього додають 0,3мл етанолу, 0,15мл хлороформу і 300мг КН2РО4. Суміш перемішують скляною паличкою і центрифугують 30хв при 6000 об/хв. Для аналізу використовують 0,1мл з верхнього шару надосаду. Активність ферменту виражають в умовних одиницях (у.о.). За у.о. приймають активність ферменту, яка здатна викликати зниження оптичної густини в процесі відновлення НТЗС в дослідній пробі на 50% в розрахунку на 1 мг білків тканини. Активність каталази визначають у розчинній фазі гомогенату за зменшенням оптичної густини при 240нм при розкладі пероксиду гідрогену під впливом каталази. Досліджувана суміш містить 50мкг білка у 50мМ К-фосфатному буфері, рН7,0 в присутності 15мМ Н2О2 в загальному об'ємі 3,0мл. Реакцію ініціюють додаванням супернатанту і вимірюють поглинання при 240нм з інтервалом 30с Активність каталази обчислюють за мілімолярним коефіцієнтом світлопоглинання пероксиду гідрогену (ε=-0,04 mМ-1·сm-1). Утворення МДА вимірюють за реакцією з 2тіобарбітуровою кислотою (ТБК). До 0,5мл гомогенату додають 1 мл трихлороцтової кислоти до кінцевої концентрації 10% і центрифугують 10хв при 3000об/хв. Для визначення МДА одержаний супернатант змішують з 1,5мл 0,7мМ розчину ТБК в 0,1М хлоридній кислоті і поміщають проби на 10хв в киплячу водяну баню, після чого додають по 3мл бутанолу та центифугують в попередньому режимі. В якості контролю використовують проби, що містять замість надосадової речовини буферний розчин (рН7,4). Утворення МДА обчислюють за інтенсивністю поглинання забарвленого верхнього шару при 532нм проти контролю на реактиви за молярним коефіцієнтом екстинції комплексу Е=1,56·105 см-1М-1. Для обчислення інтегрального показника "Індекс антиоксидантного стану" уніфікують одержані показники за формулою 1±(Мд-Мк)/Мк, де 1 - характеристика показника у тварин із умовно екологічно чистої зони вилову, Мд і Мк - середньоарифметичні значення показників тварин відповідно із умовно забрудненої та умовно чистої місцевості (контроль). Індекс антиоксидантного стану (ІАС) у досліджуваній місцевості обчислюють як відношення сум показників стану антиоксидантних факторів (А) і прооксидантних проявів (П): ІАС=ΣA/ΣП. До "А" відносять СОД та КАТ, до "П" - МДА. Контрольне значення ІАС становить 2,0. Кваліфікують біологічну відповідь і, відповідно, загальну токсичність водного середовища як: 5 45298 - "середовище малотоксичне" - ІАС становить 1,5 - 2,5 (адекватна відповідь); - "ранні ознаки токсичності" - ІАС становить більше 2,5 (стан тривоги, оксидативний стрес); - "істотне забруднення" - ІАС становить менше 1,5 (стан виснаження, пригнічення антиоксидантного захисту). Реалізація корисної моделі проілюстрована на прикладах оцінки якості водного середовища за допомогою ІАС двостулкових молюсків Anodonta cygnea (Unionidae) та Dreissena polymorpha (Dreissenidae). 6 Приклад 1 Порівнювали стан системи антиоксидантного захисту двостулкового молюска Anodonta cygnea (Unionidae) з природних популяцій у басейні р. Дністер - на бічній притоці р. Серет у парковій зоні міста Тернопіль (С-група, контроль) та на р. Нічлава у зоні інтенсивного аграрного виробництва та нижче м. Борщів (В-група) в травні, липні та вересні, використовуючи для дослідження тканину травної залози. Одержані результати представлені в таблиці 1, а етапи обчислення ІАС в таблицях 2, 3. Таблиця 1 Абсолютні значення показників стану системи антиоксидантного захисту молюска із контрольної (С) та аграрної (В) місцевостей Показники Травень С 1,4+0,3 24,0±4,3 40,1±13,1 СОД КАТ ТБК В 4,7±0,7* 6,0±0,8* 22,1±3,8* Сезон, місцевість Липень С В 2,5±0,4 1,6±0,3* 24,8±8,3 18,9+4,3 19,9±4,4 20,1±4,3 Вересень С В 3,4±0,5 2,7±0,2 34,9±12,5 26,7±7,1 17,8±0,6 16,2±0,7* Примітка. * - відмінності порівняно з контролем вірогідні, р