Штам ентероінвазивної кишкової палички escherichia coli o151 “крим” біовар 4 (еіес) № 812 для одержання профілактичної вакцини проти колібактеріозу свійської птиці

Штам ентероінвазивної кишкової палички Escherichia coli О151 "Крим" біовар 4 (ЕІЕС) № 812, задепонований у Депозитарії Державної установи "Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського" АМН України, м. Київ за номером МПМ 28-Д, для одержання профілактичної вакцини проти колібактеріозу свійської птиці. (19) (21) u200905860 (22) 09.06.2009 (24) 10.12.2009 (46) 10.12.2009, Бюл.№ 23, 2009 р. (72) САВЧЕНКО БОРИС ІВАНОВИЧ (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "УКРАЇНСЬКИЙ НАУКОВО-ДОСЛІДНИЙ ПРОТИЧУМНИЙ ІНСТИТУТ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА" 3 мікроорганізм свійської птиці, особливо в умовах промислового розведення в птахофермах [10, 11]. В 1972 році цей серовар був внесений у Міжнародну антигенну схему як Escherichia coli О151 "Крим". Антигенна формула Escherichia coli 0151 "Крим" була встановлена в 1974 році [3]. Найближчим аналогом є прототип корисної моделі еталонний штам Escherichia coli № 880-67 з антигенною формулою О151 "Крим" біовару 1, що входить в міжнародну колекцію ешеріхій. Основним недоліком цього штаму є неоднорідність біохімічних властивостей його популяцій, що є значною вадою для еталонного штаму. Вважаючи на ці недоліки перед нами була поставлена задача ізолювати штам Escherichia coli О151 "Крим" біовар 4 із стабільними біохімічними ознаками та з високою імуногенною властивістю для використання його як еталонного штаму при одержанні профілактичної вакцини проти колібактеріозу свійської птиці. Задача вирішується тим, що штам ентероінвазивної кишкової палички (ЕІЕС) № 812 - Escherichia coli О151 "Крим", біовар 4 було ізолювано та задепоновано у Депозитарії Державної установи "Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України" м. Київ МПМ № 28-Д. Дата первинного депонування 17.07.2008 р. Штам призначений для одержання профілактичної вакцини проти колібактеріозу свійської птиці. Штам № 812 Escherichia coli O151 "Крим", біовар 4 ізольовано із фекалій хворого Соломко Ю.В. 1984 р. на момент захворювання було 9 років. Захворів у осередку гострого кишкового захворювання під час відпочинку в оздоровчому літньому дитячому таборі відпочинку на березі моря "Орлятко" для дітей, підлітків в Татарбунарському районі Одеської області. Від хворих дітей, підлітків та дорослих були ізольовані штами кишкових паличок, котрі після ідентифікації були віднесені до ентероінвазивних Escherichia coli O151 "Крим", біовар 4 (4 штама) та до біовару 2 (10 штамів) . Штам зберігається в колекції мікроорганізмів Українського науково-дослідного протичумного інституті ім. І.І. Мечнікова (УНДПЧІ), як № 812 Escherichia coli 0151 "Крим", біовар 4. Колекція мікроорганізмів (УНДПЧІ) ім. І.І. Мечнікова м. Одеса згідно з наказом МОЗ України від 30 грудня 1992 р. № 183 являється філією музею патогенних мікроорганізмів - (МПМ) Академії медичних наук України науково-дослідного інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, м. Київ. Свідоцтво про первинне депонування штаму мікроорганізму в Українському науково-дослідному протичумному інституті ім. І.І. Мечникова МОЗ України. Реєстраційний номер наданого штаму ентероінвазивної кишкової палички (ЕІЕС) № 812 Escherichia coli O151 "Крим", біовар 4, МПМ № 28-Д. Дата депонування 17.07.2008 р. 46088 4 Штам ентероінвазивної кишкової палички (ЕІЕС) № 812 Escherichia coli О151 "Крим", біовар 4 характеризується наступними ознаками: Культурально-морфологічні властивості штаму - грамнегативні прямі, з незначною рухливістю, без спор палички розмірами 1,2-1,5x2,0-5,5-6,0 мкм; в мазках розташовані поодиноко, деякі парами, капсули не утворюють. Факультативні анаероби, оптимальна температура росту +37°С, утилізують глюкозу до кислоти без утворення газу, лактозу та сахарозу не ферментують. Ріст на щільних живильних середовищах: на м'ясо-пептоному агарі утворюють матово-сірі круглі з рівними краями колонії 0,3-0,5 см в діаметрі. На середовищі Ендо колір колоній відповідно кольору середовища, або без кольору розмірами 0,3-0,5 см. плоскі, випуклі у центрі сірого кольору з рівними краями. Зростання штаму на рідких середовищах: м'ясо-пептонний бульйон через 18-20 годин інкубації при +37°С дифузно мутніє. Мікроби утворюють незначну пристіночну плівку, котра при легенькому струшуванні розбивається. На дні пробірки після інкубації утворює компактний осад. Біохімічна активність штаму. Ферментує глюкозу без газу, дульцит, сорбіт (через 48 годин) з утворенням кислоти без газу, арабінозу не ферментує, утилізує гліцерин. Сірководень не утворює, утворює індол (реакція з метиловим червоним позитивна), оксидазо-негативний, желатину не гідролізує. Штам має ферменти: лізиндекарбоксилазу та орнітиндекарбоксилазу, аргініндегідролази не має. Штам гемолізує еритроцити людини на твердому живильному середовищі. Вважаючи на те, що нами було ізольовано 14 штамів Escherichia coli O151 "Крим" провели біохімічну диференціацію штамів. Матеріали з біохімічної характеристики ізольованих нами штамів ентероінвазивних кишкових паличок (ЕІЕС) - Escherichia coli O151 "Крим", наведені в Таблиці 1. Антигенні властивості. Антигенність Escherichia coli О151 "Крим", біовару 4, визначали в порівняних дослідженнях сироваток крові дітей та дорослих, що перехворіли гострим кишковим захворюванням в осередку гострого кишкового захворювання в реакції аглютинації із збудниками, що ізолювали від людей та зовнішнього середовища під час цього спалаху. Антигенність штаму Escherichia coli О151 "Крим", біовару 4, визначали в сироватках за рівнем антитіл в крові перехворілих людей в реакції аглютинації. В сироватках виявили у високих титрах наявність М та G- антитіл (1:800) до Escherichia coli O151 "Крим" біовару 4 та відсутність антитіл до Escherichia colt других сероварів, а також в РПГА до збудників псевдотуберкульозу, йерсиній ентероколітика 03,09 сероваріву . Вперше встановлена можливість зараження людини одномоментно двома бІоварами 2 та 4 Escherichia coli 0151 "Крим". 5 46088 6 Таблиця 1 Визначення бюварів ентероінвазивних кишкових паличок (ЕІЕС) Escherichia coli О151 "Крим" № 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 № культ 786 789 798 812 787 793 801 811 814 815 817 818 820 822 Біовар Глюкоза 4 4 4 4 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 К К К К К К К К К К К К К К Газ Дульцит Сорбіт Арабіноза Лізин + + + + + + + + + + + + + + +* + +* + +' +* +* +* +* +* +* + + + + + +' + + + + + + + + + + + + + + + Орнітин Аргинін Гліцерин + + + + + + + + + + + + + + + +* + + + +* +* +* + + + Примітка : + утилізація речовини через 24 години; +* - утилізація речовини через 48 годин; - відсутність ферментації вуглеводів та утилізації деяких амінокислот; Таким чином ізольовані ентероінвазивні кишкові палички ферментували глюкозу без утворення газу - так звані "безгазові" варіанти, всі штами ферментували дульцит та сорбіт також без утворення газу, 9 штамів, незалежно від біовару ферментували сорбіт через 48 годин. Кишкові палички розподілили по біоварам в залежності від їх взаємодії з арабінозою: ті штами, що ферментували арабінозу (один із них через 48 годин) були віднесені до 4-го біовару. Штами, що відносили до другого біовару не ферментували арабінози. Спільним для всіх штамів та біоварів було те, що вони мали фермент лізиндекарбоксилазу та не мали аргіниндегідролази. Всі біовари, за винятком двох штамів 2го біовару мали орнітиндекарбоксілазу. Таким чином розподіл штамів на біовари був можливим тільки за відношенням до арабінози. Штами 4-го біовару ферментували арабінозу, штами 2-го біовару не ферментували арабінози. Всі штами утилізували гліцерин через 24 години за винятком 4-х штамів 2-го біовару та одного штаму 4-го біовару, що утилізували гліцерин через 48 годин. Таким чином, в осередку гострого кишкового захворювання нами ізольовано 10 штамів Escherichia coli 0151 біовар 2 та 4 штами біовару 4. Із цих штамів по одному кожного біовару були ізольовані із кишечника хворої курки, відібраної із птахоферми. У таблиці 1 наведено дані, що підтверджують однорідність та стабільні біохімічні ознаки заявленого ізольованого штаму Escherichia coli О151 "Крим" біовар 4 у порівнянні з різними колоніями (1 і 2) прототипного штаму. Виходячи з біохімічних ознак штаму № 812 Escherichia coli О151 "Крим" біовар 4, що заявляється, може бути прийнятий, як еталонний. Таблиця 2 Порівняльна біохімічна характеристика заявленого та прототипного штамів № штамів та результати тестів 880-67 вся попу880-67 окремі ко812 біовар 4 ляція біовар 1 лонії (1) біовар 1 1 2 3 4 № штамів та Фермен- Ферментація до Ферментація до Ферментація до тація глюкози кислоти ч/з 24 г. кислоти ч/з 24 г. кислоти ч/з 24 г. Газ не утворю- Ферментація ч/з Утворення газу Газ не утворюють ють 24 год. Ферментація Ферментація від- Ферментація відФерментація лактози відсутня сутня сутня Ферментація ч/з Ферментація ч/з Ферментація ч/з Ферментація дульциту 24 год. 24 год. 24 год. Тести 880-67 також окремі колонії (2) бровар 1 5 Ферментація до кислоти ч/з 24 г. Фермент, з газом ч/з 24 год. Ферментація відсутня Ферментація год. ч/з 24 7 46088 8 Продовження табл. 2 Порівняльна біохімічна характеристика заявленого та прототипного штамів Тести 812 біовар 4 1 2 Ферментація ч/з Ферментація сорбіту 24 год. Ферментація Ферментація арабінози відсутня Ферментація Ферментація сахарози відсутня Сірководень Відсутній Уреаза Не утворюють Рухливість ± Утилізація ч/з 24 Лізин декарбоксілаза год. Орнітин декарбоксила- Утилізація ч/з 24 за год. Аргінін дегідролаза Утилізація гліцерину Не утилізують Утилізація ч/з 24 год. № штамів та результати тестів 880-67 вся попу880-67 окремі коляція біовар 1 лонії (1) біовар 1 3 4 Ферментація ч/з Ферментація 48 год. ч/з72 год. Ферментація від- Ферментація відсутня сутня Ферментація від- Ферментація відсутня сутня Відсутній Відсутній Результати відсу- Результати відсутні тні ± ± Результати відсу- Результати відсутні тні Результати відсу- Результати відсутні тні Результати відсу- Результати відсутні тні Утилізація ч/з 24 Утилізація ч/з 24 год. год. Серологічне визначення культур Escherichia coli Серологічне визначення культур Escherichia coli проводили за О-антигеном стандартного набору типоспецифічних аглютинуючих О- колі сироваток, виготовлених в Росії в науково-дослідному інституті мікробіології та епідеміології в ПетровоДальньому, Московської області. Для виготовлення антигену, 24-годинну культуру вирощену на м'ясо-пептонному агарі (МТ1А) змивали стерильним фізіологічним розчином, доводили концентрацію до 4 млр./ мл, кип'ятили у водяній бані упродовж 1 години (для порушення поверхневих термолабільних L- та В-антигенів). Охолоджені суспензії культур центрифугували упродовж 15 хвилин при 3-4 тис.об/хв.., надосадкову рідину видаляли, осад добре розбивали та використовували в реакції макроаглютинації, яку ставили у плексигласових пластинах. Сироватки розводили стерильним фізіологічним розчином. В паралельні ряди лунок вносили по 0,5 мл фізіологічного розчину та 0,5 мл сироватки та розводили від 1:25 до титру позначеного на ампулі сухої сироватки. В один ряд лунок з розведеною сироваткою вносили 0,5 мл обробленого кип’ятінням антигену, в паралельний ряд лунок вносили не оброблений антиген. Планшети з реакцією аглютинації витримували упродовж 1 години при +18°С. Результат ураховували переглядаючи пластинки у стереоскопічному мікроскопі МБС-1. При позитивному результаті утворювалися мілкозернисті аглютинати, які рівномірним шаром покривали вертикальну поверхню та дно лунки з повним просвітленням рідини. При негативному результаті антиген залишався у вигляді замутненої суспензії та випадав на дно лунки у вигляді компактного осаду. Досліджувану культуру відносили до тієї серогрупи, із 880-67 також окремі колонії (2) бровар 1 5 Ферментація ч/з 8 діб Ферментація відсутня Ферментація відсутня Відсутній Результати відсутні ± Результати відсутні Результати відсутні Результати відсутні Утилізація ч/з 48 год. сироваткою котрої вона вступала в реакцію аглютинації, до титру сироватки позначеного на етикетці ампули. Наші культури Е.соlі О151 "Крим" давали чітку позитивну реакцію аглютинації у повному титрі з гомологічною сироваткою. Перехресних реакцій з сироватками до других сероварів ентероінвазивних (ЕІЕС) та ентеропатогенних (ЕПКП) не виявили. Штам ентероінвазивної кишкової палички (ЕІЕС) № 812 - був визначений як Escherichia coli О151 "Крим" біовар 4. Вірулентність Е.coli 0 151 "Крим", біоварів 2 та 4. Дослідженнями Ібрагімова А.А. (1983) [10], Радчука Н.А. [11] було встановлено, що культури ешеріхій, патогенні для курчат були також патогенними для білих мишей, тому в наших дослідженнях визначення вірулентних властивостей ешеріхій проводили на білих безпородних мишах масою 16-18 гр. Для цього суспензію культуру у фізіологічному розчині у дозі 500 млн. мікробних клітин вводили внутрішньочеревно, на кожну дозу брали по 3 білих миші. Культуру визнавали вірулентною при загибелі однієї, або більше білих мишей впродовж 48 годин від взятої дози. При розтині загиблих мишей через 48 годин відзначали характерні патолого-анатомічні зміни: - перитоніт з гнійною рідиною у черевній порожнині, кишечник покритий гнійно-фібрінозними плівками. На стінках кишечника червоні крапки крововиливу. Печінка та селезінка збільшені в розмірах з острівками крововиливу, некрозу та гнійні острівки. В грудній порожнині густа гнійна рідина, в легенях значні острівки крововиливу, у серцевій сумці - фібрінозно-гнійний перикардит, крововилив у міокарді та острівки некрозу. Проводили бактеріологічне дослідження уражених органів та фібрінозно-гнійної рідини із черевної, грудної порожнин та із перикардіальної 9 46088 сумки та крові із серця. Із кожної проби висівали культуру Е.соlі О 151 "Крим" біовару 4. Було встановлено, що культури Е.coli О 151 "Крим" являються ентероінвазивними та токсигенними [8]. Таким чином, культура Е.соlі О 151 "Крим" біовару 4 була високо вірулентною, ентероінвазивною, що спричиняла спалах гострого дизентерієподібного захворювання у дітей, підлітків та дорослих в оздоровчому таборі "Орлятко" Одеської області. Серогрупа Е.coli О151 "Крим" відноситься до 9 других сероварів ентероінвазивних (ЕІЕС) кишкових паличок котрі мають фактори інвазії [8]. Патогенність їх пов'язана із здібністю проникати за допомогою інвазивних факторів в епітеліальні клітини слизової оболонки кишечника та розмножуватися в клітинах, що приводить до їх порушення та десквамації. Запалення локалізується у нижньому відрізку здуховиної (рос. подвздошной) кишки та у товстому кишковику. Роль факторів інвазії виконують білки зовнішньої мембрани, що кодуються плазмі дою з молекулярною масою 140 МД. Захворювання перебігає по типу дизентерії, спочатку водяниста діарея, потім колітичний синдром. Серогрупа Е.coli О151 "Крим" має два типа екзотоксинів: цитотоніни та цитотоксини. Цитотоніни стимулюють гіперсекрецію клітинами кишковика рідини в якій знаходяться іони Na+, K+ ,Сl-, бікарбонати, що приводить до порушення водносольового обміну та веде до розвитку діареї. Цитотоксини ведуть до порушення клітин епітелію капілярів та стінки кишечника. Виявлено два варіанти цитотоксинів: - термолабільні ентеротоксини (labile toxin) та термостабільні ентеротоксини (stable toxin) [8]. Встановлено, що мішенню для токсинів Е. соlі є N-глікольнейрамінова кислота (Neu5Gc), що розташовується на поверхні клітин кишковика людського організму, але в організмі людини цей сигнальний цукор не синтезується. Ентероінвазивні бактерії чекають коли молекула Neu5Gc потрапить в стравохід та в кишечник з м'ясом або з молоком та вбудується в мембрану клітин кишечника. Тільки після цього токсин проявляє свою дію. Куряче інфіковане м'ясо у великій кількості використовували в їжу, так що були всі передумови для спалаху інфекції. Нашими дослідженнями підтвержено, що Escherichia coli О151 "Крим" біовар 4 необхідно від Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 10 носити не до ентеропатогенних, а до ентероінвазивних кишкових паличок з високою вірулентністю та імуногенністю. Остання ознака являється важливою при використанні його як вакцинного штаму. Джерела інформації: 1. Цеюков С.П., Бычковский В.В., Пономарева А.А., Петушкова А.П., Бессонова М.А., Гуренко О.И. Сб. тр. Крымск. мед. ин-та и Крымск. Об-ва микробиол., иннфекцион. И педиатр. Симферополь, 1968, 26. 2. Новгородская Э.М., Семенова О.А., Арбузова В.А. "Труды Ленинградск. ин-та эпидемиологии и микробиологии им. Пастера"1968, т. 33 с. 117. 3. Киселева Б.С, Голубева И.В., Дробышевская Э.И., Киселева М.Н., Гедзе Г.И. Свичкарева А.И., Ершов А.А. Журнал эпидемиолог, и микробиолог. 1976. № 9 с. 129-133. 4. Steinruck Н., Mochamann Н., Konty I., Werner U Escherichia coli O151:K-h 10('krim") as etiologic agent of diarrhea. Zetrable Bacteriosol. A. 1980 248 (3)-335-44. 5.Свичкарева А.И., Голубева И.В., Киселева B.C. и др. - "Журнал микробиол", 1973, № 4, с. 148-149. 6. Оrn-Anong Ratchtrachenchai, Sarayoot Subpasu, Hideo Hayashi and William Ba-Thein Prevalence of childhood diarrhea-associated Escherichia coli in Thailand. J Med. Microbiol 53 (2004), 237-243. 7. Голубева И.В., Киселева Б.С. В кн.: Кишечные и респираторные инфекции, физическое развитие и состояние здоровья молодежи ЭССР (8-ая Республиканская конференция). Таллин, 1974, с. 19-21. 8. Коротяев АИ., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. Учебник для медицинских вузов. Санкт-Петербург 2000 с. 373-377. 9. Райзе Ф.Е. "Труды Ленинградск. ин-та эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, 1973, т. 40, с. 132-137. 10. Ибрагимов А.А., Осколков B.C., Голод ЯР. Патогенез и диагностика смешанной респираторной инфекции птиц. // Ветеринария-1983.-№ 12. с. 33-35. 11. Радчук Н.А. Колибактериоз птиц. Ленинград В.О. "Агропромиздат" с. 70. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601