Штам ентероінвазивної кишкової палички escherichia coli o151 “крим” біовар 2 (еіес) №818 для одержання діагностичної сироватки

Штам ентероінвазивної кишкової палички Escherichia coli О151 "Крим", біовар 2, (ЕІЕС) № 818, депонований у Депозитарії Державної установи "Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського" AMН України, м. Київ, за номером МПМ 27-Д, для одержання діагностичної сироватки. (19) (21) u200813496 (22) 24.11.2008 (24) 10.08.2009 (46) 10.08.2009, Бюл.№ 15, 2009 р. (72) САВЧЕНКО БОРИС ІВАНОВИЧ, ХАБЛО ЗОЯ АНДРІЇВНА (73) УКРАЇНСЬКИЙ НАУКОВО-ДОСЛІДНИЙ ПРОТИЧУМНИЙ ІНСТИТУТ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА 3 43125 для одержання діагностичної сироватки, а також як вакцинний штам для профілактики захворювання колібактеріозом свійської птиці. Штам №818 Escherichia coli О151 "Крим", біовар 2 ізольовано із фекалій хворої Гулъчук И.В. 1973р. народження, на момент захворювання 20 років. В осередку гострого кишкового захворювання працювала кухарем. В осередку гострого кишкового захворювання від дітей, підлітків та дорослих були ізольовані 10 штамів кишкових паличок, котрі після ідентифікації були віднесені до ентероінвазивних (ЕІЕС) Escherichia coli О151 "Крим", біовар 2, що мали стабільну біохімічну та високу імуногенну активність. Основною відмінністю ізольованого нами штаму від прототипу-штаму Е.соlі №880-67 є виявлення штаму з більш стабільними та однорідними біохімічними характеристиками. Порівняльна характеристика наведена в Таблиці 1. Штам Escherichia coli №818 О151 "Крим", біовар 2 характеризується наступними ознаками: 4 Культурально-морфологічні властивості штаму - грамнегативні прямі, з незначною рухливістю, без спор палички розмірами 1.2-1,5х2,0-5,5-6,0мкм; в мазках розташовані поодиноко, деякі парами, капсули не утворюють. Факультативні анаероби, оптимальна температура росту + 37°С, утилізують глюкозу до кислоти без утворення газу, лактозу та сахарозу не ферментують. Ріст на щільних живильних середовищах: на м'ясо-пептонному агарі утворюють матово-сірі круглі з рівними краями колонії 0,3-0,5см в діаметрі. На середовищі Ендо колір колоній відповідав кольору середовища, розміром 0,3-0,5см, плоскі, опуклі у центрі з рівними краями. Зростання штаму на рідких середовищах: у м'ясо-пептонному бульйоні: рівномірне дифузне помутніння середовища через 18-20 годин інкубації при +37°С. Утворює незначну пристіночну плівку, котра при легенькому струшуванні розбивається без утворення пластівців. На дні пробірки після інкубації утворює компактний осад без пластівців. Таблиця 1 Порівняльна таблиця біохімічних характеристик прототипного штаму №880-67 Е.соlі О151: "Крим" бювар 1 штамів та №818 Е. соlі О151: "Крим" біовар 2 к + ч/з добу 880-67 вся популяція к + + ч/з 2 доби 880-67 окремі колонії к + ч/з 3 доби 880-67 інші колонії к + + ч/з 4-8 діб Уреаза Результати відсутні Рухливість Лізин декарбоксилаза Орнітин декарбоксилаза ± + ± Результати відсутні + Результати відсутні Аргінін і дегідролаза Результати відсутні Утилізація гліцерину ч/з одну-дві доби ч/з добу Макс. титри і антитіл 1:800. G-1:800 Результати відсутні Результати відсутні ± Результатів немає Результати відсутні Результати відсутні ч/з добу Результати відсутні Тести 818 Ферментація глюкози Утворення газу Ферментація лактози Ферментація дульциту Ферментація сорбіту Ферментація арабінози Ферментація сахарози Сірководень Біохімічна активність штаму. Ферментує глюкозу без газу, дульцит. сорбіт (через 24 години) з утворенням кислоти без газу, арабінозу не ферментує, утилізує гліцерин (через 24-48 годин). Сірководень не утворює, утворює індол (реакція з метиловим червоним позитивна), оксидазонегативний, желатину не гідролізує, не розкладає арабінози. Штам має ферменти: лізиндекарбоксилазу та орнітиндекарбоксилазу, аргиніндегідролази не мас. Штам гемолізує еритроцита людини на твердому живильному середовищі. Серологічне визначення культур Escherichia coli. Серологічне визначення культур Escherichia Результати відсутні ± Результати відсутні Результати відсутні Результати відсутні ч/з добу Результати відсутні coli проводили за О-антигеном стандартним набором типоспецифічних аглютинуючих О-колі сироваток, зробленими в науково-дослідному інституті мікробіології та епідеміології в ПетровоДальньому, Московській області. Для виготовлення антигену 24-х годинну культуру вирощену на м'ясо-пептонному агарі (МПА) змивали стерильним фізіологічним розчином, доводили концентрацію до 4млр./мл, прогрівали у водяній бані при +100°С впродовж 1 години (для порушення поверхневих термолабільних L та В-антигенів). В реакції аглютинації використовували також не оброблені теплом суспензії культур. Охолоджені суспензії 5 культур центрифугували упродовж 15 хвилин при 3-4тис.об/хв., надосадковурідину видаляли, осад добре розбивали та використовували в реакції мікроаглютинації в лунках плексигласових пластин. Сироватки розводили стерильним фізіологічним розчином. В лунки пластини вносили по 0,5мл фізіологічного розчину та розводили від 1:25 до титру сухої сироватки. В кожну лунку з розведеною сироваткою вносили по 0,5мл антигену. Планшети з реакцією аглютинації витримували упродовж 1-ї години при кімнатній температурі. Результат ураховували, переглядаючи пластинки у стереоскопічному мікроскопі МБС-1. При позитивному результаті виявляли дрібнозернисті аглютинати, які рівномірним шаром покривали вертикальну поверхню та дно лунки з повним просвітленням рідини. При негативному результаті антиген залишався у вигляді суспензії та випадав на дно лунки у вигляді осаду. Культуру, що досліджували, відносили до серогрупи, із сироваткою якої вона вступала в реакцію аглютинації до титру сироватки. Наші 10 культур Е.соlі О151 "Крим" давали чітку позитивну реакцію аглютинації у повному титрі з гомологічною сироваткою. Перехресних реакцій з сироватками до других сероварів ентероінвазивних (ЕІЕС) та ентеропатогенних (ЕПКП) кишкових паличок не виявляли. Штам ентероінвазивної кишкової палички (ЕІЕС) №818 - був визначений як Escherichia coli О151 "Крим". Вірулентність Е.соlі О151 "Крим", біовар 2. Серогрупа Е.соlі О151 "Крим" належить до 9 других сероварів ентероінвазивних (ЕІЕС) кишкових паличок, що мають фактори інвазії. Патогенність їх пов'язана із властивістю проникати за допомогою інвазивних факторів в епітеліальні клітини слизової оболонки кишечника та розмножуватися у клітинах, що веде до їх порушення та десквамації. Локалізація процесу у нижньому відрізку здухвинної (рос. подвздошной) кишки та у товстій кишці. Роль факторів інвазії виконують білки зовнішньої мембрани, що кодуються плазмідою з молекулярною масою 140мД. Захворювання перебігає за типом дизентерії, спочатку водяниста діарея, потім колітичний синдром. Серогрупа Е.соlі О151 має два типи екзотоксинів: цитотоніни та цитотоксини. Цитотоніни стимулюють гіперсекрецію рідини клітинами кишечника, в якій знаходяться іони Na+, К+, Сl-, бікарбонати, що ведуть до порушення водно-сольового обміну та до розвитку діареї. Цитотоксини ведуть до порушення клітин епітелію капілярів та стінки кишечника. Виявлено два варіанти цитотоксинів: - термолабільні ентеротоксини (labile toxin) та термостабільні ентеротоксини (stable toxin) [4]. Дослідженнями Ібрагімова А.А. [6], Радчука Н.А. [7] було встановлено, що культури ешеріхій патогенні для курчат були також патогенними для білих мишей, Тому в наших експериментах з визначення вірулентних властивостей Е.соlі О151 "Крим", біовар 2 використовували білих беспородних мишей масою 16-18гр. Для цього суспензію культури у фізіологічному розчині у дозі 500 млн. мікробних клітин вводили внутрішньочеревно, на кожну дозу брали по 3 білих миші. Культуру визнавати вірулентною при загибелі однієї, або більше 43125 6 білих мишей впродовж 48 годин у взятій дозі. При розтині загиблих мишей через 48 годин відмічали характерні патолого-анатомічні зміни: перитоніт з гнійною рідиною у черевневій порожнині, кишечник був покритий гнійно-фібрінозними плівками. На стінках кишечника червоні крапки крововиливу, печінка та селезінка збільшені в розмірах з острівками крововиливу, некрозу та гнійні острівки. В грудній порожнині густа гнійна рідина в тканині легень значні острівки крововиливу, у серцевій сумці: фібрінозно-гнійний перикардит, крововилив у міокарді та острівки некрозу. Проводили бактеріологічне дослідження уражених органів та фібрінозно-гнійної рідини із черевної, грудної порожнин та із перикардіальної сумки та із крові серця, із кожної проби висівали культуру Е.соlі О151 "Крим", біовар 2. Таким чином було встановлено, що культура №818 E.соlі О151 "Крим" являється ептероінвазивпою та токсигенною [4]. Імуногенність культур Escherichia coli Імуногенність визначали в порівняльних дослідженнях сироваток крові дітей та дорослих, що перехворіли гострим кишковим захворюванням в осередку гострого кишкового захворювання в реакції аглютинації із збудниками, що ізолювали від людей та зовнішнього середовища під час цього спалаху та визначали наявність антитіл до можливих збудників ентероколіту таких як Yersinia enterocolitica О3, О9 сероварів. Yersinia pseudotuberculosis в реакції пасивної аглютинації з комерційними діагностикумами. Для визначення титру антитіл до Escherichia coli О151 "Крим", біовар 2 використовували 3 штами культур. Для виготовлення антигенів 24 годинні культури вирощені на м'ясо-пептонному агарі (МПА) змивали стерильним фізіологічним розчином. доводили концентрацію до 4млр/мл, прогрівали у водяній бані при +100°С впродовж 1 години (для порушення поверхневих термолабільних L та В-антигенів). Паралельно в РА брали не оброблені теплом культури. Охолоджені суспензії культур центрифугували упродовж 15 хвилин при 3-4тис.об/хв., надосадкову рідину видаляли, осад добре розбивали та використовували в реакції мікрооб'ємної аглютинації, в лунках плексигласових пластин. Сироватки інактивували при +56°С 30хв. розводили стерильним фізіологічним розчином. Відомо, що антитіла класу IgG мають домінуючу роль в гуморальному імунітеті при інфекційних захворюваннях. Для визначення класу імуноглобулінів однакові об'єми кожної сироватки обробляли 2-меркаптоетанолом. Реакцію аглютинації проводили одночасно, паралельно, використовуючи одномоментно приготовані антигени. В лунки пластини вносили по 0,5мл фізіологічного розчину та титрували сироватку від 1:25 до 1:800. В кожну лунку плексигласової пластинки з розведеною сироваткою вносили 0,5мл антигену. Планшети з реакцією аглютинації витримували упродовж 1 години при кімнатній температурі. Результат ураховували переглядаючи пластинки у стереоскопічному мікроскопі МБС 1. При позитивному результаті утворювалися дрібнозернисті аглютинати, які рівномірним шаром покривали вертикальні поверхні та дно лунки з повним просвітленням рідини. При негативному 7 43125 результаті антиген залишалися у вигляді суспензії та випадали на дно лунки у вигляді осаду. Визначали останню лунку з аглютинацією мікроорганізмів, що була титром антитіл сироватки. Наші культури Е.соlі О151 "Крим" біовар 2 давали чітку позитивну реакцію аглютинації у високих титрах. Результати дослідження сироваток в реакції аглютинації (РА) штамами Е.соlі О151 "Крим", біовар 2 (3 антигени), з антигеном (Klebsiella pneumonia): E.coli О142, Е.coli О33. В РНГА Yersinia enterocolitica, O3, O9 сероварів, Yersinia 8 pseudotuberculosis (Табл. 2). Перехресних реакцій з сироватками до других сероварів ентероінвазивних (ЕІЕС) та ентеропатогенних (ЕПКП) не виявлено. Середньоарифметичні титри антитіл отримані до кожного штаму Е.соlі О151 „Крим” наведені в Таблиці 2. Визначали останню лунку з аглютинацією мікроорганізмів в останньому розведенні сироватки, що була тигром сироватки. Наші культури Е.соlі О151 "Крим" біовар 2 Таблиця 2 Результати дослідження сироваток в реакції аглютинації (РА) штамами E.coli О151 "Крим" біовар 2 (3 антигени), з антигеном (Klebsiella pneumonia) E.coli О142, E.coli О33. В РНГА: Yersinia enterocolitica О3, О9 сероварів, Yersinia pseudotuberculosis. № Ініціали Вік Професія Ізольовані культури 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Г.И.В. Д.Л.В. К.Л.А. З.И.Ю. А.Л.А. Ф.Т.А. И.Е.В. С.Т.Е. В.С.А Т.А.Д. Л.Е.Ю. Г.Л.В. К.Н.А. 20 18 18 18 18 19 18 19 18 18 18 18 18 Овочі кухар кухар мийка Овочі гарнір кухар кондитер кухар м'ясник м'ясник Овочі Овочі 14 М.И.А. 18 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 У.Л.А. Г.Л.Ф. К.О.П. Т.Л.И. З.Л.И. О.Г.Н. Т.Е.О. С.Т.П. Г.Ю.В. Ж.Ю.В. Х.И.П. Г.С.П. Б.И.В. А.Н.В. Ш.В.В. Ш.В.В. Ш.Е.В. 32 33 34 Титри антитіл Титри антитіл O 142 Кl.рn O 33 негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат Y.ent O3 O9 негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат негат негат негат Негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат Негат негат Y.pst М G E.coli О151 E.coli О151 E.coli О151 E.coli О151 E.coli О151 E.coli О151 не обстежена не обстежена не обстежена не обстежена E.coli О151 не обстежена E.coli О151 1:267 1:200 1:333 1:200 1:533 1:200 1:800 1:467 1:800 отр. 1:267 1:200 1:400 кондитер не обстежена 1:633 18 18 19 22 22 34 21 20 23 20 21 20 26 22 18 23 18 кухар кухар холод, цех мийка мийка майстер офіціант офіціант уборщик офіціант мийка офіціант кухар кухар кухар кухар кухар 1:800 1:83 1:400 1:267 1:800 1:800 1:100 1:133 1:533 1:66 1:667 1:100 1:133 1:400 1:66 1:267 негат С.О.П. 8 відпочив. 1:167 1:800 негат негат негат негат Щ.В.Ф. Е.Е.В. 22 18 Уборщик кухар не обстежена не обстежена не обстежена не обстежена не обстежена не обстежена не обстежена не обстежена не обстежена не обстежена не обстежена не обстежена не обстежена E.coli О151 не обстежена не обстежена не обстежена E.coli О151 Кl. pneumonia E.coli О151 не обстежена 1:400 1:400 1:800 1:200 1:200 1:200 1:800 негат 1:800 1:50 1:800 1:200 1:800 сиров. відсут негат негат 1:200 1:333 1:200 1:800 негат негат 1:100 негат 1:800 негат 1:200 1:800 1:100 негат негат 1:266 негат 1:800 негат. негат негат негат негат негат негат негат негат Примітка. В таблиці представлені середньоарифметичні титри антитіл, що були визначені в реакції аглютинації до трьох антигенів штамів ентероінвазивної кишкової палички (ЕІЕС) Е. Соli О151 "Крим", біовар 2 9 43125 давали чітку позитивну реакцію аглютинації. Перехресних реакцій у сироватках хворих та перехворілих до антигенів ентеропатогенних кишкових паличок (ЕПКП) (наприклад до Е.соlі О142) та до культури Klebsiella pneumonia, Yersinia enterocolitica та Yersinia pseudotuberculosis в РПГА не було виявлено. Для встановлення класу імуноглобулінів сироватки обробляли 2меркаптоетанолом. Результати дослідження сироваток в реакції аглютинації (РА) штамами E.coli О151 "Крим" біовар 2 (3 антигени), з антигеном (Кlеbsіеllа pneumonia) E.coli O142, E.coli O33 та в В РНГА: Yersinia enterocolitica О3, О9 сероварів, Yersinia pseudotuberculosis, В таблиці наведено середньоарифметичні титри антитіл, що були визначені в реакції аглютинації до трьох антигенів штамів ентероінвазивної кишкової палички (ЕІЕС) Е.Соlі О151 "Крим", біовар 2. Таким чином, ізольований нами штам, має більш стабільні біохімічні ознаки, є безгазовим варіантом кишечної палички, має високу імуногенну активність. Джерела інформації: 1. Киселева Б.С., Голубева И.В., Дробышевс Комп’ютерна верстка А. Крулевський 10 кая Э.И., Киселева М.Н., Гедзе Г.И. Свичкарева А.И., Ершов А.А. Журнал эпидемиолог. и микробиолог. 1976. №9 С. 129-133. 2. Escherichia coli О151: K-: ("krim" as etiologic agent of diarrhea. Zenrrabalt Bacteriol A. 1980; 248(3): 335-44. 3. Голубева И.В., Киселева Б.С. В кн.: Кишечные и респираторные инфекции, физическое развитие и состояние здоровья молодежи ЭССР (8-ая Республиканская конференция). Таллин, 1974, с. 19-21. 4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. Учебник для медицинских вузов. Санкт-Петербург, 2000 С. 373-377. 5. Райзе Ф.Е. "Труды Ленинградск. ин-та эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, 1973, т. 40, с. 132-137. 6. Ибрагимов А.А., Осколков B.C., Голод Я.Р. Патогенез и диагностика смешанной респираторной инфекции птиц. // Ветеринария - 1983. - №12. С.33-35. 7. Радчук Н.А. Колибактериоз птиц. Ленинград В.О. "Агропромиздат" С. 70. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601