Композиція для стимуляції репараційно-регенераційних процесів “альгофіт” /”algophyt”/

1 Композиція ДЛЯ стимуляції репараційнорегенераційних процесів, яка містить біомасу водорості, яка відрізняється тим, що вона додатково містить біомасу женьшеню, а як водорость спіруліну при співвідношенні їх бюмас 1 1 2 Композиція за П 1, яка відрізняється тим, що вона містить біомасу женьшеню, отриману методом культури клітин 3 Композиція за п 2, яка відрізняється тим, що вона містить біомасу женьшеню, отриману при культивуванні штаму Panax japomcus С А Меу (repens) - ВСКК-ВР № 62 Винахід відноситься до біологи, медицини, ветеринари та косметологи, а саме до репараційнорегенераційних засобів, і може бути використаний з метою стимуляції відновних процесів організму Репараційно-регенераційні засоби, що інтенсифікують процеси дедиференціації клітин, а також мають протизапальну, антимікробну дію, здебільшого застосовуються при терапії травматичнотрофічних ушкоджень шкіри та глибше розташованих тканин різної етіології термічних, ХІМІЧНИХ, радіаційних ОПІКІВ, простих, відкритих ран, виразок, трофічних порушень, особливо ускладнених інфікуванням стійкою до хімпрепаратів мікрофлорою, тощо Медична практика свідчить, що найбільш ефективними серед ряду препаратів подібної дії є засоби природного, зокрема рослинного, походження в порівнянні зі сполуками ХІМІЧНОГО синтезу внаслідок їх спорідненості за метаболічними процесами з теплокровним організмом, а також зменшення числа обмежень та побічної дії при використанні Слід підкреслити, що препарати рослинного походження можуть виступати у ролі загальних адаптогенів, що значно підвищують неспецифічну резистентність організму до більшості негативних чинників (1) Найбільш перспективним методом отримання сировини для виготовлення препаратів з таким характером дії є бютехнолопчний спосіб, оскільки він є високопродуктивним, екологічно чистим, контрольованим, незалежним від кліматичних умов та інших як абіотичних, так і біотичних чинників На СЬОГОДНІШНІЙ день арсенал засобів, що здатні стимулювати репараційно-регенераційні процеси організму, досить обмежений Особливо це стосується фітокомпозицій, що, як правило, є більш ефективними, ніж їх окремі компоненти Відоме використання настоянки (1 10) з кореня женьшеню справжнього (2) та настоянки (1 10) з біомаси культури штаму ІФРЖ1 (БІО-2) женьшеню справжнього -"Бюженьшень" (3) як адаптогенних засобів, що інтенсифікують загальні процеси обміну речовин в організмі Настоянки містять такі фізіологічне активні речовини специфічні для роду женьшеню тритерпенові глікозиди з агліконами даммаранового ряду протопанаксадюлом чи протопанаксатриолом (панаксозиди або пнзенозиди), ІНШІ сапоніни, ефірні та жирні олп, пектинові речовини та ІНШІ вуглеводи, вітаміни групи В, які найбільш ефективно діють у комплексі Відомий препарат Ungmntum Algofmum (25 50%), який найбільш близький за фізіологічною дією до композиції, що заявляється Він МІСТИТЬ суміш бюмас мікроводоростей, до складу якої як ДІЮЧІ речовини входять натрієві солі поліненасичених жирних кислот, каротиноїди, ПОХІДНІ хлорофілів, плівкоутворювачі на основі природних церезинів (4) Препарат підсилює репараційні та регенераційні процеси, має протизапальні та пперосмолярні властивості, знижує по О 00 ю 00 48258 казники токсикозу у хворих з широкими опіками, трофічними порушеннями з різноманітними ускладненнями, радіаційними виразками (5) Цей засіб вибраний як прототип Задачею винаходу є створення нового більш ефективного комплексного засобу для стимуляції репараційно-регенераційних процесів Поставлена задача досягається тим, що запропонована композиція містить біомаси з кореня або культури клітин женьшеню, а також мікроводорості спіруліни при їх співвідношенні 1 1 При цьому фізіологічна активність речовин з цих бюмас значно підвищується при їх одночасному застосуванні Це пояснюється тим, що біохімічний склад біомаси женьшеню доповнюється унікальними речовинами з біомаси спіруліни, що призводить до синергічного ефекту їх комплексної Д" Для роботи було обрано біомаси з кореня женьшеню справжнього (Panax ginseng С А Меу) плантаційного вирощування, штамів культур женьшеню справжнього І Ф Р Ж 1 (БІО-2)- ВСККВР №3, ІФР Ж 2 - ВСККВР №1 та нововиведеного штаму женьшеню японського (Panax japomcus С А Меу (repens) P34 - ВСККВР №62, задепонованих у Всеросійській спеціалізованій колекції клітин вищих рослин, а також спіруліни з колекції водоростей Інституту гідробіологи НАНУ (Spirulma platensis (Nordst) Geitl HPDP-60/128) Зокрема, штам культури клітин Р34, виведений у 1997 році в Інституті харчової хімії і технології Укрхарчопрому і НАНУ з кореня інтактної рослини дворічного віку (після стерилізації матеріалу розведеним розчином препарату "Білизна"), являє собою 2 КЛІТИННІ лінії Р3 та Р4, перша з яких (найбільш продуктивна) характеризується такими основними ознаками це крихка (на твердому середовищі) тканина від світло-жовтого до світлокоричневого кольору з вмістом сухої маси 5,0 6,8%, КІЛЬКІСТЮ живих клітин 75 - 92% ( клітини двох типів меристемні та паренхімні розміром від 25 до 200мкм) та продуктивністю сухої маси 1,0 1,5г/дм 3 середовища на добу На агаризованому середовищі індекс росту дорівнює 5,4 - 6,0, крива росту має типову S-подібну форму з лаг-фазою (до 3 дня), фазою прискорення росту (з 3 по 7 день), ЛІНІЙНОЮ фазою (з 7 по 15 день), фазою уповільнення росту (з 15 по 29 день) та стаціонарною фазою (з 29 по 36 день) На рідкому середовищі індекс росту становить 14 - 16, крива росту має типову S-подібну форму з лаг-фазою (до 3 дня), фазою прискорення росту (з 3 по 7 день), ЛІНІЙНОЮ фазою (з 7 по 14 день), фазою уповільнення росту (з 14 по 15 день), стаціонарною фазою (з 15 по 18 день) та фазою деградації (з 18 по ЗО день) Визначено, що біомаси з женьшеню містять панаксозиди у кількостях ВІДПОВІДНО 1,5 - 2,0% від сухої маси (корінь плантаційного вирощування), 0,02 - 0,06 (штами ІФР Ж1 та ІФР Ж2) та 1,2 - 1 , 8 % (штам Р34), а також ІНШІ сапоніни, ефірні олії, незвичні олігопептиди та жирні кислоти, поліацетиленові ПОХІДНІ, низькометаксильовані пектини, вітаміни групи В Біомаса спіруліни має високий вміст білка (до 70%) з усіма незамінними амінокислотами, вугле водів (до 20%) у тому числі біологічно активних полісахаридів (зокрема з антибіотичними, противірусними, антиоксидантними, протипухлинними властивостями), жирів (до 8%) з підвищеною часткою ненасичених жирних кислот, макро- і мікроелементів (до 10%), пігментів (хлорофілів, фікоціанінів), вітамінів (А, С, В-і, В 2 , Вє, В-і2, В с , Е), органічних кислот Тобто вирішення поставленої задачі забезпечується також тим, що в композиції використовується біомаса підвищеної фізіологічної активності з кореня женьшеню справжнього або з нововиведеного штаму культури клітин женьшеню японського разом з комплексом біологічно активних сполук спіруліни Ефективність та можливість практичної реалізації винаходу підтверджується конкретними прикладами Приклад 1 Біомасу женьшеню справжнього з клітин культур штамів ІФР Ж1 (БІО-2) та ІФР Ж 2 одержували шляхом їх вирощування у стерильних умовах на твердому або рідкому середовищах Мурасіге і Скута такого складу (мг/дм 3 ) NH 4 NO 3 1145-1850, KN0 3 1490-2100, СаСІ 2 х 2Н 2 0 420 - 500, MgS0 4 х 7Н 2 0 350 - 400, КН2Р04 150-210, НзВОз 4,2-8,0, MnS04x4H20 15,6-26,7, ZnS04x7H2O 6,0-10,3, KJ 0,53 - 0,90, Na2Mo04x2H2O 0,15-0,30, CuS04x5H20 0,02-0,075, CoCI2x6H20 0,02-0,075, FeS04x7H20 25,0-30,0, Na 2 EflTO 26,1-40,1 з додаванням тіамш-хлориду (0,4 - 0,8), aнафтилоцтової кислоти (1,8 - 2,2), сахарози (2 5%), агар-агару - для твердого середовища (0,6 0,8%) При культивуванні штаму ІФР Ж1 до середовища додатково вносили кінетин (0,8 - 1,2), мезошозит (80 - 100) та гідролізат казеїну (500 - 700) рН середовища - 5,5 - 5,9 (до автоклавування) Вирощування проводили у темноті при температурі 26+1 °С та ВІДНОСНІЙ вологості повітря 67+4% При поверхневому культивуванні використовували банки МІСТКІСТЮ 250см 3 з об'ємом поживного середовища 40 - 60см 3 КІЛЬКІСТЬ калусного шокуляту складала 1,0 - 7,5г сухої маси/дм 3 середовища, цикл вирощування - ЗО - 35 діб При суспензійному вирощуванні на шейкері (115 - 120об/хв, радіус обертання - 6,0 - 8,5мм) використовували КОНІЧНІ колби МІСТКІСТЮ 1дм 3 з об'ємом поживного середовища 240 - 300см 3 КІЛЬКІСТЬ суспензійного інокуляту складала 1,0 1,5г сухої маси/дм 3 , цикл вирощування - 1 7 - 18 днів Одержану біомасу відокремлювали від середовища за допомогою фільтрації, промивали дистильованою водою та висушували при температурі 40 - 50°С до повітряно сухого стану Спіруліну вирощували на стерильному середовищі Зарукка такого складу (г/дм ) NaHC0 3 16,8, 48258 К2НР04хЗН20 NaNO 3 K2SO4 NaCI MgS0 4 x 7H 2 0 1,0, 2,5, 1,0, 1,0, 0,2, CaCI 2 x6H 2 0 0,04 До комплексу солеи основного середовища після стерилізації додавали розчини сумішей мікроелементів 1 та 2 по 1см 3 кожного, які виготовляли таким чином (г/дм3) Розчин 1 НзВОз МпСІ2х4Н2О ZnS0 4 х 7Н 2 0 CuS04x5H20 М0О3 Розчин 2 2,86 1,81 0,22 0,08 0,015 рН середовища - 8,2 - 8,4 (після автоклавування і додавання мікроелементів) КІЛЬКІСТЬ шокуляту - 0,1 - 0,3г сухої маси/дм 3 середовища Водорість вирощували у напівперюдичному режимі в бюреакторах АКЛ-10 з щоденним відбором 1/4 - 1/3 загального об'єму (Юдм 3 ) та додаванням такої ж КІЛЬКОСТІ ЧИСТОГО середовища Перемішування суспензії проводили за допомогою механічної мішалки (50 - 100об/хв) Температуру підтримували у межах 28 - 35°С Освітлення здійснювали лампами типу Ж (сума 100 - 200Вт або 8 - 12клк)Альгологічну чистоту перевіряли мікроскопічним методом Відокремлення біомаси від середовища проводили центрифугуванням при 8 тис об/хв Сконцентровану біомасу промивали від залишку солей дистильованою водою, знову відокремлювали центрифугуванням і ліофільне висушували Біомаси женьшеню та спіруліни ретельно розтирали та змішували у співвідношенні 1 1 Приклад 2 Біомасу женьшеню японського з клітин культури штаму Р з 4 одержували так, як описано в прикладі 1 для штаму І Ф Р Ж 1 , з додатковим включенням до складу поживного середовища нікотинової кислоти (0,45 - 0,55мг/дм 3 ), піридоксину (0,08 0,12), 2,4-дихлорфеноксиоцтовоі кислоти (тільки для лінії Рз - 0,18 - 0,20) та зменшенням КІЛЬКОСТІ тіамш-хлориду (0,08 - 0,12) Біомасу спіруліни та приготування композиції проводили так, як описано у прикладі 1 Приклад З Біомасу з кореня женьшеню справжнього отримували шляхом плантаційного вирощування рослин в Миронівському районі Київської області протягом 5 років за стандартним методом (на сірих підзолистих ґрунтах з використанням світлозахисних щитів) ПІСЛЯ збирання коренів їх ретельно очищали від бруду, подрібнювали та висушували Біомасу спіруліни та приготування композиції проводили так, як описано у прикладі 1 Приклад 4 Для перевірки біологічної активності та можливості досягнення репараційно-регенераційного ефекту композицій, виготовлених так, як описано у прикладах 1 - 3, проведено досліди на культурах клітин кісткового мозку цуценят Суть методу полягає у т о м у , що при наявності біологічної активності ВІДПОВІДНИХ препаратів, відбувається "омолодження" культури клітин, і при цитологічному дослідженні забарвлених мазків аналізі мієлограм клітин кісткового мозку виявля NH 4 VO 3 K 2 Cr 2 (S0 4 ) 4 х 24Н 2 0 NiS0 4 х 7Н 2 0 Na2W04x2H20 Ti 2 (S0 4 ) 3 Co(N03)2x6H20 0,023 0,096 0,048 0,018 0,040 0,044 ється так званий "зсув ліворуч", тобто збільшення частки недиференціиованих поліпотентних клітин ретикулоцитів (мієлобластів, промієлоцитів) При недостатній активності досліджуваного препарату, навпаки, відбувається старіння культури клітин кісткового мозку, що виявляється на мієлограмах у "зсуві праворуч", тобто збільшенні частки диференційованих клітин Кістковий МОЗОК цуценят зі стегнової кістки нарізали кубиками розміром 1мм , клали їх по одному на покрівне скло, занурювали у гомогенну плазму, яку попередньо наливали у лунку предметного скла та завойовували по краях для запобігання висиханню препарату При цьому досліджували дію водних екстрактів бюмас та композицій Для виготовлення екстрактів до бюмас та композицій додавали дистильовану воду у співвідношенні 1 частка біомаси женьшеню, спіруліни або їх сумішей до 1 частки води, настоювали при кімнатній температурі протягом, 2 - 5 годин з перемішуванням кожні ЗО хвилин та відокремлювали супернатант центрифугуванням при 8 тис об /хв Екстракти бюмас та композицій, до яких додавали хлористий натрій до концентрації фізіологічного розчину, вводили безпосередню у плазму у КІЛЬКОСТІ 0,03 - 0,05см 3 залежно від об'єму камери (0,3 0,5см 3 ), тобто у співвідношенні 1 10 Підготовлені препарати переносили до термостату (36 - 37°С), через 48 годин тканини мозку фіксували метанолом та забарвлювали за Паппенгеймом При обліку прораховували щонайменше З виборки по 1000 клітин Результати цих досліджень наведено у таблиці 1 Аналіз даних цієї таблиці свідчить про те, що достовірні результати по "омолодженню" культур клітин кісткового мозку цуценят (збільшення КІЛЬКОСТІ ретикулоцитів) мають препарати з бюмас клітин штаму женьшеню японського Рз 4 , кореня женьшеню справжнього, спіруліни, а також усіх досліджених композицій При цьому фізіологічна активність біомаси женьшеню, отриманої з штаму Рз 4 методом культури клітин, не поступається активності біомаси женьшеню плантаційного вирощування, що корелює з вмістом у бюмасах специфічних речовин - панаксозидів Найбільший ефект виявлено при дії суміші бюмас женьшеню та спіруліни Приклад 5 Значний репараційно-регенераційний вплив композиції бюмас женьшеню та спіруліни 48258 підтверджували в дослідах на лабораторних тваринах (кролях), яким попередньо було нанесено рани різного виду (прості, інфіковані за стандартною методикою, травматично-трофічні за феноменами Шварцмана та Артюса-Сахарова) Для перевірки дії композиції, виготовленої так, як описано у прикладі 1 та 2, робили настоян 8 ки біомас При цьому до біомас додавали розчини 20 - 70% етилового спирту у співвідношенні 1 частка біомаси женьшеню, спіруліни або їх суміші до 10 Матеріал настоювали протягом 7 - 1 0 діб при кімнатній температурі з перемішуванням, а далі відокремлювали супернатант центрифугуванням при 8 тис об /хв Таблиця 1 Вплив водних екстрактів біомас женьшеню і спіруліни та їх композиції на первинну культуру клітин (мієлограми клітин) кісткового мозку цуценят № 1 2 3 4 Варіанти Мієлобласти Контроль (фон) 56±7 Штам женьшеню справжнього ІФР 69±17 Ж1 Штам женьшеню справжнього ІФР 59±12 Ж2 Штам женьшеню Промієлоцити Сума ретику Мієлоцити ЕозиБазонофіфшьні льні Полшуклеари Мета ЛОЦИТІВ Нейтрофшьні 100±11 156±18 93±8 5±1 13±1 цити 98±9 109±21 178±38 98±17 5±1 15±2 107±28 166±40 98±10 6±1 99±12 216±28 МІЄЛО Нейтро- ЕозиБазофіли філи нофіли ЛімМоно- Еритрофоцицити цити ти 474±29 27±3 20±2 21±3 10+1 83±1 100±12 445±36 26±8 19±4 22±3 8±3 84±6 11±3 99±17 460±27 27±12 20±3 20±4 9±2 84±12 6±1 14±3 98±17 398±21 27±12 19±3 27±4 15±4 81 ±4 76±8 140±20 5 Ж е н ь ш е н ь плантаційного виро- 79±21 щування 136±18 215±39 Р