Евритермальний штам мікроорганізму bacillus species № 205 – деструктор вуглеводнів, поверхнево-активних речовин і ксенобіотиків та їх сполук

Евритермальний штам мікроорганізму Bacillus species № 205 (Bacillus species IMBB - 7044), який використовується для деструкції вуглеводнів, поверхнево-активних речовин і ксенобютиків в комплексі, в широкому діапазоні температур. Bacillus species №205 задепонований в Інституті мікробіологи і вірусологи НАН України їм Д К Заболотного Культурально-морфолопчні ознаки клітини уявляють собою гр (+), рухомі перітрихіальні жгутування, спороутворюючі палички розміром 1,2x1,4x0,6 - 0,9мкм Створюють термостійкі ендоспори розміром 0,5-0,7мкм На лептонному агарі (МПА) при температурі +28°С, 48 годинах культивування створюють НІЖНІ прозорі колони, потім стають безколірними, потім кремові, ІНОДІ пігмент проникає в субстрат Створення пігменту відбувається від краю до центру колонії Колонія гладка, блискуча, краї хвилясті На м'ясо-пептонному бульйоні (+28°С, 48 годин) створює плівку і муть На агаризованому середовищі Кінга створює пігмент шоколадно-коричневого кольору На синтетичному мінеральному середовищі, на морській воді (+28°С, 48 годин) створює МІЛКІ сіруваті колони діаметром 1,5 - 2,3мм Колонії на твердих агаризованих середовищ не ослизнюються протягом тривалого збереження Фізюлого-бюхімічні ознаки Факультативний аероб Здатний рости при температурі від 10°С до 42,5°С Оптимум зростання 20-27°С Зріст на середовищі з NaCL - 5%, 7%, 10% і вище Морська сіль - 1,8%, амоній хлористий - 1,0г, калій фосфорнокислий двозахищений - 1,0г, дестибютин - 0,001% розчину (або дріжджовий екстракт - 1 мл, вода водопровідна - 1000мл, рН середовища 7,2-7,5 з добавкою нафти і нафтопродуктів зріст у вигляді рівномірного змутніння) Відношення до вуглеводородів Росте на середовищах, які містять нафту, па О 00 48901 рафін, О-ксілол, дизельне паливо, мастильне мастило Розкладає ксенобютики, які відносяться до азофарбників і діазофарбників СТІЙКІСТЬ ДО солей важких металів Cd-ЮО у/мл, Ug - 25 у/мл, Сг+3-1ООу/мл, Сг +6 - 25у/мл РЬ від 25у/мл до 1000у/мл, Zn-ЮООу/мл, Оксилази створює (+), Каталази створює (+), Лециталази створює (+), Желатин розжижує, Аміак не створює, Сірчистий водород не створює, Відношення до Твін 80 - позитивне, Нітроредуктази не створює Здібність до утилізації різних вуглеводів Субстрат Здібність до утилізації цукрів Глюкоза +х, Лактоза+, Макнит+, х+ Здібність до утилізації вуглеводів Відношення до антибіотиків Чутливий до таких антибіотиків стрептоміцину, гентаміцину, катаміцину, левоміцетину, тетрацикліну, ампіцикліну, анандоміцину, поліміксину Запропонований штам утилізує в якості джерела живлення нафту, нафтопродукти (дизельне паливо), ксенобютики (оранжевий діазофарбник Sundizamme Orange GR) Повне зруйнування вуглеводородів відбувається в морському середовищі при використанні додаткових біогенних стимуляторів, наприклад, дестибютину, дріжджового екстракту В аналогічних умовах штам Bacillus species №205 здійснює 98-100% деструкцію нафти у концентрації 45 Омг/л за 24 години, 98-100% - дизельного палива в концентрації 450мг/л, 20 діб, 98 100% - ксенобютиків в концентрації 300мг/л за 24 доби і 93-100% - ксенобютики + нафтопродукти (в комплексі) в концентрації 600 с/л - 36 діб ПАР - сульфенол в концентрації 001% з додаванням ксенобютика та бензола - 2,5 с/л за добу Штам вивільнює від вуглеводородів (нафти, дизельного палива) і ксенобютиків (оранжевий, діазофарбник - Sunchramim Orang GR) морську воду без введення додаткових видів мікроорганізмів Приклад 1 Мікробну деструкцію нафти здійснюють наступним чином морську сіль - 1,8%, амоній хлористий - 1,0г, калій фосфорно-кислий двозаміщений 1,0г, дестибютин (0,001% розчину) або дріжджовий екстракт - 1мл, вода водопровідна - 1000мл (рН середовища 7,2-7,5) Нафту, використану в якості субстрату для деструкції, вводили в КІЛЬКОСТІ 450мг/л, 350мг/л, 250мг/л, 150мг/л, 100мг/л, 50мг/л і 13500мг/л, рН середовища регулювали 10%-ним NaOH Деструкцію проводили штамом Bacillus species № 205, попередньо культивованим на рибопентонному агарі (РПА) протягом 36 годин при температурі 22°С і ДВІЧІ відмитим мінеральним середовищем вказаного складу (без вуглеводородів) шляхом центрифугування при 4тис об/хвил протягом 10 хвилин Для створення оптимальних умов для деструкції вуглеводородів клітинами бактерій, колби у перші 2 години розміщували на гайдалку Наступне культивування здійснювали в стаціонарних умовах при 22°С Результати деструкції враховували за зникненням нафтової плівки через 24 години, 19 годин, 13 годин, 8 годин, 5,3 годин, 2,6 годин та 33 доби Діапазон культивування (+6 -+22°С) Результати деструкції нафти наведені у таблиці 1 Таблиця 1 Мікробна деструкція нафти в морській воді eurythermal Bacillus species 205 / періодичне культивування (в евритермальних умовах) в діапазоні +6 - +22°С Субстрат для деструкції 1 Нафта Нафта Нафта Нафта Нафта Нафта Нафта (приклад (приклад (приклад (приклад (приклад 1) 2) 3) 4) 5) Вміст вуглеводороду (концентрація, с/л) 2 450 350 250 150 100 50 13500 Приклад 2 Для мікробної деструкції дизельного палива готували штучний розчин морської води вищенаведеного складу Дизельне паливо в якості субстрата вносили в КІЛЬКОСТІ 450мг/л, 400мг/л, 350мг/л, 300мг/л, 250мг/л, 200мг/л, 150мг/л, 100мг/л, 50мг/л, 25мг/л Час, год % 3 24 19 13 8 5,3 2,6 33 4 98 99 100 100 100 100 100 и 2275 м г/л Результати деструкції враховували по зникненні в середовищі плівки через 20, 17, 15, 13, 11 діб, 156, 104, 52, 26 годин та 95 діб Результати деструкції дизельного палива приведені утаблиці 2 48901 Таблиця 2 Мікробна деструкція дизельного палива в морській воді еврітермального штаму Bacillus species - 205 (періодичне культивування в діапазоні температур +6 - +22°С) Вміст дизельного палива, мг/л 2 450 400 350 300 250 200 150 100 50 25 2275 Субстрат для деструкції Дизельне Дизельне Дизельне Дизельне Дизельне Дизельне Дизельне Дизельне Дизельне Дизельне Дизельне паливо паливо паливо паливо паливо паливо паливо паливо паливо паливо паливо 1 (приклад (приклад (приклад (приклад (приклад 1) 2) 3) 4) 5) Приклад З Мікробну деструкцію ксенобютика оранжевий діазофарбник (Sundi-zamme Orange GR) здійснювали методом описаним у прикладі 1 Оранжевий діазофарбник в якості субстрата для деструкції уводили в КІЛЬКОСТІ 300мг/л, 150мг/л, 100мг/л, 50мг/л, 25мг/л і 1075мг/л Результати деструкції Термін год, тижні Ефект деструкції, % 3 468-20 416-17 364-15 312-13 260-11 208-9 156-6 104 52 26 95 4 98 99 100 100 100 100 100 100 100 100 100 враховували за зникненням оранжевого діазофарбника в середовищі через 24 доби, 20, 16, 12, 8 діб, 96 годин, 48 годин і 81 добу Результати деструкції оранжевого діазофарбника (Sundizamine Orange GR) приведені в таблиці З Таблиця З Мікробна деструкція ксенобютики в морській воді Bacillus species 205 (періодичне культивування) в діапазоні температур +6 - +22°С Субстрат для деструкції Вміст ксенобютика, мг/л Термін год , доба 1 Оранжевий діазофарбник (Sundizamine Orange GR) (приклад 1) Оранжевий діазофарбник (Sundizamine Orange GR) (приклад 2) Оранжевий діазофарбник (Sundizamine Orange GR) (приклад 3) Оранжевий діазофарбник (Sundizamine Orange GR) (приклад 4) Оранжевий діазофарбник (Sundizamine Orange GR) (приклад 5) Оранжевий діазофарбник (Sundizamine Orange GR) Оранжевий діазофарбник (Sundizamine Orange GR) 2 3 Ефект деструкції до ксенобютиків, % 4 300 576-24 98 250 480-20 99 200 384-16 99 150 288-12 100 100 192-8 100 50 96-4 100 25 48 100 1075 81 100 Оранжевий діазофарбник (Sundizamine Orange GR) Приклад 4 Комплексну деструкцію вуглеводнів нафти і ксенобютика в морській воді здійснюють способом, описаним у прикладі 1 В якості субстрату для деструкції вводили оранжевий діазофарбник (Sundizamine Orange GR) + дизельне паливо в КІЛЬКОСТІ бООмг/л, 500мг/л, 400мг/л, 300мг/л, 200мг/л, 100мг/л, 50мг/л і 2150мг/л Результати деструкції враховували за зникненням оранжевого діазофарбника і плівки у середовищі через 36 діб, ЗО, 24, 18, 12, 6, 3 діб і 4 місяця Результати комплексної деструкції, вуглеводнів нафти (дизельне паливо) і ксенобютика ора 7 48901 нжевого діазофарбника (Sundizamme Orange GR) приведені в таблиці 4 Таблиця 4 Мікробна деструкція вуглеводородів нафти (дизельне паливо)і ксенобіотика (оранжевого діазофарбника Sundizamme Orange G R ) B морському середовищі Bacillus species 205 (періодичне культивування, температура культивування +6 - +22°С) Субстрат для деструкції комплексів (вуглеводороди+ксенобютики) 1 Оранжевий діазофарбник (Sundizamme Orange GR) + дизельне паливо (приклад 1) Оранжевий діазофарбник (Sundizamme Orange GR) + дизельне паливо (приклад 2)Оранжевий діазофарбник (Sundizamme Orange GR) + дизельне паливо (приклад 3)Оранжевий діазофарбник (Sundizamme Orange GR) + дизельне паливо (приклад 4)Оранжевий діазофарбник (Sundizamme Orange GR) + дизельне паливо (приклад 5) Оранжевий діазофарбник zamme Orange GR) +дизельне (приклад) Оранжевий діазофарбник zamme Orange GR) +дизельне паливо (приклад) Оранжевий діазофарбник zamme Orange GR) + дизельне (Sundiпаливо (Sundi(Sundiпаливо Вміст ксенобіотика і вуглеводорода нафти (концентрації), мг/л 2 Термін доба Ефект деструкції комплексу (вуглеводород + ксенобютик), % 3 4 300+300=600 36 98 250+250=500 ЗО 99 200+200=400 24 100 150+150=300 18 100 100+100=200 12 100 50+50=100 6 100 25+25=50 3 100 1075+1075=2150 116=4 100 Приклад 5 Комплексну деструкцію вуглеводнів нафти (бензол) - 50%, ксенобіотика (червоний - red с б е с ) - 50% і ПАР (сульфшол) - 0 , 0 1 % проводили у морській воді Вносили бактеріальну суспензію еврітермального штаму Bacillus species 205 в КІЛЬКОСТІ 10 7 -10 8 кл/мл КІЛЬКІСТЬ субстрату уводи ли (12,5мг/л (в комплексі), також послідовно в комплексі - 50мг/л, 100мг/л, 150мг/л, 200мг/л, 250мг/л, 300мг/л Сульфонол (ПАР) в КІЛЬКОСТІ 0,01% додавали в середовище разом з вуглеводородом і ксенобютиком Культивування проводили в діапазоні температур 16-22°С Таблиця 5 Деструкція ксенобіотика (азофарбник червоний red с - 6-е с ), вуглевода (бензол) і ПАР 16-22°С (періодичне культивування)евритермальним штамом Bacillus species 205 Субстрат для деструкції 1 Ксенобютик - азофарбник (червоний red с - 6 с с ) + бензол+ПАР [(сульфонол) 0,01%] приклад 1 Ксенобютик - азофарбник (червоний red с - 6 с с ) + бензол+ПАР [(сульфонол) 0,01%] приклад 2 Ксенобютик - азофарбник, (червоний red с - 6 с с ) + бензол+ПАР [(сульфонол) 0,01%] приклад 3 Вміст субстрату, мг/л 2 Термін, год , доба 3 Ефект деструкції, % 4 12,5+12,5=2,5 24 100 25+25=50 48 100 50+50=100 4 100 Продовження табл 5 10 48901 1 2 Ксенобютик - азофарбник (червоний red с - 6 с с) + бензол+ПАР [(сульфонол) 0,01%] приклад 4 Ксенобютик - азофарбник (червоний red с - 6 с с) + бензол+ПАР [(сульфонол) 0,01%] приклад 5 Ксенобютик - азофарбник (червоний red с - 6 с с) + бензол+ПАР [(сульфонол) 0,01%] приклад Ксенобютик - азофарбник (червоний red с - 6 с с) + бензол+ПАР [(сульфонол) 0,01%] приклад Ксенобютик - азофарбник (червоний red с - 6 с с) + бензол+ПАР [(сульфонол) 0,01%] 3 4 75+75=150 6 100 100+100=200 8 100 125+125=250 10 100 150+150=300 12 100 1075 44 100 Співставляючи приведені приклади, можна зробити висновок, що запропонований евритермальний штам Bacillus species № 205, в порівнянні з прототипом, спроможний викликати максимальну деструкцію нафти зі швидкістю 16, 75мг/л за годину, дизельного палива - 24мг/л за годину, ксенобіотика (оранжевого діазофарбника Sundizamine Orange GR) - 13,3мг/л за добу, вуг леводорода (дизельне паливо) + ксенобіотика (оранжевий діазофарбник - Sundizamine Orange GR) у комплексі - 18,5мг/л за добу на 96-100% в морській воді при температурі +6 - +22°С, а також ксенобіотика (азофарбник - червоний red с 6 е е ) + бензол+ПАР [(сульфонол) - 0,01%] зі швидкістю 25мг/л речовини за добу на 100% в широкому діапазоні температур 16-22°С ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71