Флюпіртин як активна речовина для профілактики та лікування захворювань, пов’язаних з індуктивним апоптозом лімфоцитів

1 Застосування флюпіртину або його фармацевтично придатних солей як активної речовини для лікування або попередження хвороб, пов'язаних з індуктивним апоптозом лімфоцитів 2 Застосування за п 1, яке відрізняється тим, що лікування включає лікування ВІЛ-інфікованих або хворих на СНІД пацієнтів 3 Застосування за п 1, яке відрізняється тим, що флюпіртин або його солі являють собою комбінації з речовинами-носіями та/або допоміжними фармацевтично придатними речовинами для ВІДПОВІДНИХ форм застосування О Винахід стосується використання флюпіртшу або його солей як лікарського засобу для профілактики та лікування захворювань, пов'язаних з пошкодженням клітин системи кровотворення, таких як, наприклад, лімфоцитів Флюпіртін є відомим, призначеним для внутрішнього з введення, центрально діючим неопіумним анальгетиком Свої анальгетичні дії флюпіртін виявляє через ІНШІ ДІЮЧІ механізми, аніж опіат/опюїдні анальгетики (Nickel В, Postgrad Med J 63 (Suppl 3), 19 (1987), Szelenyi L, Nickel B, Borbe И О , Brune К BrJ Pharmacol 143,89(1989)) В електрофізіологічних дослідженнях було виявлено, що флюпіртін здатен втручатися у ноцицептивні "події як на надспинномозковому, так і на спинномозковому рівнях (Cansson К Y , Jurna I Eur J Pharmacol 143,89 (1987), Bleyer H , Carlsson К H , Erkel HJ , Jurna I Eur J Pharmacol 151,259 (1988), Nickel B, Aledter A Postgrad Med J 63 (Suppl 3)41 (1987)) Флюпіртін використовується також для лікування у випадках гострого болю, спричиненого захворюваннями апарату руху Крім того, флюпіртін призначається для ефективного лікування пацієнтів, які мають дегенеративні та ревматичні захворювання Поряд з хорошими анальгетичними якостями флюпіртін має властивості розслаблювати м'язи, завдяки чому він може застосовуватись для лікування м'язових судом або захворювань, викликаних судомами м'язів (DE 40 22 442) В подальших дослідженнях мюрелаксаційної дії флюпіртшу, яке було проведене на пацюках, було встановлено, що дія флюпіртшу може гальмуватись через збуджуючу амінокислоту N-метилD-аспартат (NMDA) Виходячи з антагоністичного ефекту NMDA флюпіртін підходить також для лікування захворювань центральної нервової системи, таких як церебральна ішемія, нейродегенеративні захворювання, епілептичні припадки (DE 43 27 516) 3 точки зору ХІМІЧНОГО аналізу флюпіртін містить 2-амшо-3-етоксикарбоніламшо-6-(р-фторбензиламшо)-піридин Синтез флюпіртшу та його фармацевтичне придатних солей описаний в патентах DE 17 95 858, DE31 33 519TaDE34 16 609 00 (О ю 51682 Було також зроблене цікаве відкриття, що використовувалось MEM середовище, з додаванфлюпіртін спроможний гальмувати апоптоз клітин ням ЮмМ буферу HEPES, 2,6% бікарбонату насистеми кровотворення, наприклад, лімфоцитів трію, ЮОум од / мл пеніциліну, 100мкг/мл стрептоЗавдяки цьому з'являється можливість застосовуміцину, 10% фетальної сироватки великої рогатої вати флюпіртін для лікування хвороб, пов'язаних з худоби (ФС) та 1мМ глютамату В разі необхідноспошкодженням клітин системи кровотворення ті, на клітини діяли ХІМІЧНИМИ речовинами відразу ж після виділення Особливого значення при цьому набуває лікування ВІЛ- інфікованих /хворих на СНІД пацієнтів Індукція апоптозу реактивним киснем Ефект, що випливає згідно винаходу, необхідРеактивні радикали кисню були отримані при но пояснити детальніше на основі фармакологічзастосуванні системи гіпоксантину (ГК) та ксантиних досліджень ноксидази (КОД) (Bruck et al , 1994) Фармакологічні дослідження МНК суспендували протягом 24 годин в загальному об'ємі 500мкл мінімального підтримуючого Флюпіртш-малеат, [2-амшо-З- етоксикарбонісередовища MEM (як це описано вище) ламшо-6-(р-фтор-бензиламшо)-піридин-малеат], для приготування ВІЛ-1-gp 120 був введений В цю вихідну суміш додавали від 0 до 80МІЛЛІ штам вірусу ВІЛ-1 Т-клітинного лейкозу людини одакт/мл КОД та 1мМ ГК При концентрації 8HTLV щ (Popovic et al , 1984) Чистота отриманого е МІЛЛІ од акт/мл КОД (Sigma, Munchen, FRG)> 90% виділеного препарату др 120 була більш 95%, що лімфоцитів зазнавали апоптоз було підтверджено електрофорезом в поліакрілаЗа відсутністю інших умов, для наступних домідному гелі (Muller et al ,1988) сліджень були введені 10 МІЛЛІ од акт/мл ферменту КОД та 1мМ ГК При цих умовах інкубації 50% Вивчення антиретровірусної активності клітин зазнавали апоптоз Є доцільним витримуваМетодика приготування ВІЛ-1 була вже описати цей ступінь апоптозу, і, якщо це піддається конна раніше (Sann et al, 1987) Клітини лінії фібробтролю, встановити, чи являє встановлена сполука ластів людини СЕМ (ЩІЛЬНІСТЬ посіву 1 x 1 0 клітин потенційним інгібітором або стимулятором апопто/см3) були суспендовані у середовищі та інфіковані зу вірусом ВІЛ-1 (штам HTLVne ) Для цього використовували 50- одиниць 50% - ноі інфекційної дози Флюпірітін додавався до клітин за 6 годин до ВІЛ для культур клітин (CCID50) CCID50- це інфекзастосування системи, яка виділяє радикал кисню, 3 ційна доза, при якій інфікується 50% клітин на см інкубація завершувалась через день клітинної суспензії 1см3 культури був шкубований Аналіз клітин методом проточної цитометрм протягом 5 днів Флюпіртін додавався до клітин в Апоптоз вимірювався в проточному цитометрі різних концентраціях за 2 години до зараження FACScan (Becton-Dickmson) стимуляцією аргоноКІЛЬКІСТЬ ЖИВИХ КЛІТИН визначалась при застосувого лазера при довжині хвиль 488нм методом, ванні 3[4,5-диметилтіазол-2-ил]-2,5відомим з публікацій (Schmid et al , 1994) Лімфодифенілтетразолій-бромід [МТТ] калориметричної цити були розділені оптичним методом і характетестової системи (Scudiero et al ,1988) Оцінку ризувались тим, що процес відбувався завдяки результатів проводили за допомогою рідера для комбінації поступального переднього світлорозсіELISA, як це відзначалось в публікаціях раніше ювання як виміру для розміру клітин [FSC] з пер(Muller et al ,1991) Після інкубації двократні розвепендикулярним розсіюванням як виміру для поведення неінфікованих клітин СЕМ мали показник рхової структури [SSC] Для підфарбовування 2,16, а інфікованих- 0,13 апоптозних МНК клітин останні ресуспендували в забуференому фізіологічному розчині (ЗФР) з Аналізи крові 20мкг/мл 7-амшоактиноміцину D [7-AAD] (Sigma) Зразки периферійної крові були (і) отримані від протягом 20 хвилин при 4°С в темряві Нарешті, дванадцяти ВІЛ-1 інфікованих гомосексуалістів [вік клітини могли аналізуватись за допомогою прото22-43 роки, середній вік 35 років], а також (м) від чного цитометра в підфарбованому розчині Червосьми здорових ЧОЛОВІКІВ, серонегативних по ВІЛвона флюоресценція, обумовлена 7 AAD, реєстру1, подібної групи ризику приблизно однакової вівалась фільтром з довжиною хвиль 650нм 7-AAD кової групи (вік 23-35 років, середній вік ЗО років) входить в апоптозні клітини за рахунок дезинтегПацієнти були розділені згідно класифікації рацм клітинних мембран і підфарбовує ДНК завдя«Центра контролю над захворюваннями» (ЦКЗ, ки інтеркаляцм Аналіз даних проводився з викори1992) Дослідження серопозитивних по ВІЛ-1 пацістанням програми LYSIS II єнтів були проведені на основі аналізів крові безсимптомних вірусоносіїв (ЦКЗ А1, А2, середнє Середня КІЛЬКІСТЬ каналів була перерахована число клітин CD 4 -407/мкл, розкид - 209на середню інтенсивність флюоресценцм, розміри 698/мкл) Жоден з пацієнтів не виявляв ознак пухклітин та структуру поверхні линних захворювань, симптоматичних інфекцій та Флюоресцента мітка in situ способом суміші не проходив за 10 тижнів до здачі аналізів крові TdT, а також мічення поверхні лікування, яке б пригнічувало імунну систему, наДля визначення субпопуляцм клітин, які заприклад, лікування кортикостероїдами знають апоптоз, клітини обробляли за допомогою системи кінцевої трансферази [TdT] ЗастосовуваКЛІТИННІ препарати та лікування ними вся метод Gorczyc et al (1993) з незначними моМононуклеарні клітини ([МНК)] були виділені дифікаціями Клітини В суспензії промивали ДВІЧІ та концентровані з гепаринізованої крові центриЗФР (Gibco), а після цього фіксували в 1% парафугуванням за допомогою градієнтів Фікол-Ппагформальдегіді (Riedel de Haen) протягом 10 хвиДіхте (Rossol etai , 1990) 0,5 х 106 клітин були лин при 4°С Потім КЛІТИНИ ДВІЧІ промивали ЗФР (з культивовані в бактеріологічному середовищі в додаванням 5% АВ-сироватки та 0,5% бичого сикінцевому об'ємі 500мкл, в якості середовища 51682 роваточного альбуміну (БСА) Надалі клітини осаВплив флюпіртіну на спонтанний приріст апопджували за допомогою 50мкл 2,5мМ розчину хлотозу лімфоцитів людини риду кобальту з додаванням 0,5нМ біотину- 16Периферійна кров МНК здорових, так само як і dUTPTa 25 од акт TdT і ресуспендували Ця суміш ВІЛ-1 інфікованих досліджувалась на спонтанний була стабілізована завдяки буферу з 200мМ какоапоптоз Клітини аналізували через день після дилату калію, 25мМ тріс-НСІ та 0,25мг/мл бичого забору крові в групі досліджуваних На схемі 2 посироваточного альбуміну, інкубація відбувалася казано, що 6,32 ± 0,82 % МНК клітин у контрольних при 37°С ЗО хвилин, ВІДПОВІДНО даним виробника групах неінфікованих досліджуваних зазнають (Boehnnger Mannheim, Mannheim, FRG) Клітини апоптоз у цих часових межах, в той час як 28,42 ± промивали ДВІЧІ ЗФР (5% АВ- сироватки та 0,5% 7,84% клітин інфікованих ВІЛ-1 пацієнтів пережиБСА) та суспендували удруге в 100 мкл буферного вають апоптоз підфарбованого розчину, який містив 5мкг/мл МНК обох груп обробляють протягом 24 годин 3 флюресцеш-ізотюцианату [ФІТЦ], міченого авідифлюпіртіном в концентрації від 0,1 до 30мкг/см ном ( аналіз чистоти клітин) Для одночасного міЗгідно схеми 2 витікає, що приріст спонтанного чення поверхні клітини обробляли додатково апоптозу лімфоцитів під впливом флюпіртіну не 20мкг/мл міченими фікоеритрином моноклональхарактеризується значною зміною значень ( Р > ними анти-СОЗ антитілами (Becton-Dickmson) 0 1) Це стосується клітин здорових досліджуваних, так само як і інфікованих ВІЛ-1 пацієнтів Флюоресценцію вимірювали за допомогою проточної цитометрм, як це було описано у Зменшення індуктивного апоптозу в мононукHalhwell (1987) леарних клітинах завдяки флюпіртіну Результати МНК здорових досліджуваних, а також ВІЛ-1 інфікованих пацієнтів обробляли системою ГК/КОД Лікування флюпіртіном інфікованих ВІЛ-1 СЕМ (утворення радикалів кисню) для індукції апоптозу клітин Флюпіртін додавали до клітинної суміші за 6 годин Клітини СЕМ обробляли протягом 2 годин і заперед індукційною експозицією в різних концентлишали після цього неінфікованими або паралераціях Як показано на схемі 3 флюпіртін в концельно інфікували ВІЛ-1 Через 5 днів була визначентрації між 0,1 та 3,0мкг/см спричиняв значне на КІЛЬКІСТЬ клітин у ВІДПОВІДНИХ сумішах Як зменшення апоптозу клітин (Р> 0,001) При концепоказано на схемі 1, залежність концентрації клінтрації флюпіртіну 10мкг/см захисний ефект відтин в неінфікованих та інфікованих культурах від значався лише в пробах з лімфоцитами інфіковаконцентрації флюпіртіну була незначною (Р> 0,1) ної групи досліджуваних Флюпіртін додавався до суміші в кінцевій кон3 центрації від 0,1 до 30мкг/см Концентрація клітин При концентрації від 0,3 до 3,0мкг/см3 флюпірв неінфікованій суміші складала 446 880 ± 31 020 тіну захисний ефект лікувального засобу був найклітин/см3, в ВІЛ-1 інфікованій суміші 108 420 ± більше вираженим і сильніше всього гальмував 6 710 клітин/см3 Ці результати свідчать про те, що індуктивний апоптоз флюпіртін не має токсичного впливу на клітини, а Зменшення індуктивного апоптозу в суміші з подалі не впливає на інфекцію ВІЛ-1 in vitro лімфоцитами здорових досліджуваних складав приблизно 40%, а в групах інфікованих ВІЛ-1 паціВстановлення системи ппоксантин/ксантин окєнтів-приблизно 60% сидази Концентрація ксантин-оксидази (КОД) була Апоптоз був виявлений в лімфоцитах також вибрана такою, щоб процент частин апоптозних методом ДНК-фрагментацм Після інкубації клітин клітин становив приблизно 50% Апоптозні клітини системою ГК/КОД з клітин була виділена ДНК, виявляють флюоресцентну інтенсивність > 10 дорозділена в агарозному гелі та перенесена блоттівільної КІЛЬКОСТІ каналів При 0 МІЛЛІ од акт КОД нгом ВІДПОВІДНО розмірам 6,6 ± 2,1% клітин знаходяться над цією «відрізаДНК розпалась на кристалоподібний зразок, ною» ЛІНІЄЮ межі з >10 довільної КІЛЬКОСТІ каналів, що має вигляд СХІДЦІВ, І складається з фрагментів тобто 6,6% були апоптозними При збільшенні 180 пар основ з багатьма гранями Подібний фраконцентрації КОД процентна частина апоптозних гментарний візерунок характерний для деструкції клітин збільшується і досягає при 80 МІЛЛІ од акт ДНК , що виникає в апоптозних процесах (Wylhe КОД значення 93,2 ± 6,8% апоптозних клітин При ,1980) Клітини, ЯКІ обробляють 1мкг/см3 флюпірті10 МІЛЛІ од акт приблизно 50% (точніше 54,6 ± ном, не виявляють, навпаки, ніякої фрагментації 6,1) клітин зазнають апоптоз У випадку відсутності ДНК КОД клітини FSC /SSC виявляють такий зразок Так само існують і репрезентативні дотрозподілу блоттінги, які виявляють ефект флюпіртіну на клітинах, що переживають спонтанний та індуктивний Розміри клітин 349 ± 27 (довільна КІЛЬКІСТЬ каапоптоз налів) у порівнянні зі структурою поверхні 112 ± 15 При концентрації ферменту 80 МІЛЛІ од акт розміДля проведення цієї серії експериментів в ри клітин зменшуються і досягають значення 256 ± МНК був викликаний апоптоз способом системи 22, в той час як ступінь структури поверхні збільГК/20 МІЛЛІ од акт КОД За цих умов при відсутношується на 180 ± 29 Такі зміни свідчать про харасті флюпіртіну 64,2 ± 7,9% клітин виявилися апопктерний апоптоз, що базується на морфологічних тозними змінах клітин При 10 МІЛЛІ од акт КОД клітини Коли ж ці клітини обробляли протягом 24 говиявляють зразок розподілу, що знаходиться в дин флюпіртіном, число апоптозних клітин значно середині екстремальних значень, виявлених вище зменшувалося на 18,3 ± 5,8% Якщо не зазначено інакше, вводять 10 МІЛЛІ Ці показники однозначно свідчать про те, що од акт ферменту флюпіртін є перспективним засобом для лікуван 51682 ня, наприклад, індуктивного апоптозу лімфоцитів у пацієнтів, хворих на СНІД В DE-OS 43 27 526 описуються нейропротективна дія флюпіртшу, наприклад, при церебральній ішемії, хворобах Альцгеймера, Паркінсона, спричинених інфекційними нейродегенеративними захворюваннями, такими як СНІД-енцефалопатія або хвороба Якоба-Крейтцфельдта СНІД-енцефалопатія з прогресуючою деменцією являє неврологічне ускладнення захворювання на СНІД Причиною виникнення СНІДенцефалопатм вважається, поряд з іншими факторами, викликаними ВІЛ (др 120), вивільнення NMDA-агоністично ДІЮЧИХ нейротоксинів, таких як хінолінова кислота, з інфікованих макрофагів, які в результаті приводить до відмирання нервових клітин СНІД-енцефалопатія і захворювання на СНІД (синдром набутого імунодефіциту) є захворюваннями, що стосуються різних систем органів У випадку з першим захворюванням мова іде, як вже було зазначено, про неврологічне ускладнення хвороби на СНІД (апоптоз нервових клітин), в той час як друге захворювання являє «набуту імунну недостатність», яка зумовлена порушенням системи клітинного імунітету з різко вираженим зменшенням Т-хелперних клітин (апоптоз клітин - складових частин системи кровотворення) Дія флюпіртшу, згідно винаходу, - гальмування індуктивного апоптозу клітин системи кровотворення, як наприклад, лімфоцитів, - була тим більше вражаючою, що існування рецепторів NMDA зовні центральної нервової системи до цього не було виявлено ВІДПОВІДНО ДО ЦЬОГО ДЛЯ спеціаліста не існувало можливості перейти від захисту нервових клітин флюпіртіном до захисту клітин системи кровотворення Можна назвати наступні захворювання, що піддаються профілактиці та лікуванню, виходячи з ефективної дії флюпіртіну, підтвердженої на основі винаходу - нейтропенія/лімфоцитофенія, викликані медикаментами (такими як цитостатики, кортикостероїди), отруйними речовинами, опроміненням, та ІНШІ диспластичні захворювання - тромбоцитопенія, спричинена інфекційним або медикаментозним шляхом Флюпіртін може дозуватися для профілактичних та лікувальних цілей відомим шляхом в наступних формах застосування таблетки, таблетки в целофановій упаковці, капсули із жорсткого желатину, капсули з м'якого желатину, гранули, речовини в гранулах, драже, гемороїдальні свічки, мікрокапсули, водяні або масляні суспензії, масляні 8 розчини, розчини ІНЄКЦІИ для внутрішньомязового застосування, ІН'ЄКЦІЙНІ розчини для внутрішньовенного застосування Потрібні солі для виробництва ЛІКІВ Є ВСІ фізіологічно сумісними солями флюпіртшу Наприклад, мова може іти про пдрохлорид, малеат, сульфат та глкжонат флюпіртіну Вміст флюпіртшу у об'єктах винаходу складає 0,1мг -3 000мг, доцільніше 50мг-500мг Названі окремі дози ЛІКІВ можуть застосовуватись 1-5 разів, переважно 1-3 рази на день Флюпіртін є завжди основою для даних по дозуванню Якщо застосовуються солі флюпіртшу, розрахунки проводяться ВІДПОВІДНО ДО молекулярної маси Фармацевтичні та галенові операції виконуються згідно традиційних методів Наприклад, флюпіртін та/або ДОПОМІЖНІ речовини та речовининосм добре перемішують та гомогенізують при температурі між 20 та 80°С, переважно від 20 до 50°С Опис схем Схема 1 Інкубація нешфікованих [о ] та ВІЛ-1 - інфікованих клітин СЕМ [ І ] з різною концентрацією флюпіртшу Наводяться середні значення 10 паралельних експериментів, середні відхилення були не вище 10% Схема 2 Ефект флюпіртіну , отриманий на спонтанному апоптозі лімфоцитів нешфікованих досліджуваних [відкрите мозолисте тіло ]та ВІЛ-1 - інфікованих пацієнтів [ діагональне смужкове мозолисте тіло] Через день клітини були проаналізовані за допомогою проточної цитометрм Лімфоцити 12 інфікованих і 8 нешфікованих пацієнтів були досліджені, середнє значення і відхилення від норми наводяться Схема З Зменшення індуктивного апоптозу лімфоцитів після лікування флюпіртіном МНК нешфікованих досліджуваних (відкрите мозолисте тіло) та інфікованих ВІЛ-1 пацієнтів (діагональне смужкове мозолисте тіло) були доведені за допомогою ГК/КОД системи до апоптозного відмирання Флюпіртін додавався клітинам за 6 годин перед генеруючою системою кисневого радикалу Наступного дня клітини були проаналізовані за допомогою проточної цитометри Результати загального апоптозу були реєстровані, виходячи з цього були відраховані показники спонтанного апоптозу Досліджувались лімфоцити 12 інфікованих та 8 нешфікованих пацієнтів, середні показники та відхилення від норми надаються 51682 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71 10