Штам aerococcus viridans 167

Штам Aerococcus viridans 167 (колекція мікроорганізмів філії Національного депозитарію патогенних для людини мікроорганізмів на базі Харківського інституту мікробіологи й імунологи їм І І Мечникова - інв № 1006 від 15 лютого 2002 р) продуцент біологічно активних речовин Винахід відноситься до мікробіологи і стосується нового штаму мікроорганізму з роду Aerococcus, від - viridans № 167 Мікроорганізми роду Aerococcus мають низьку патогенність, і інфекції, викликані ними у людини, реєструють досить рідко, звичайно це особи, що страждають різною патологією або імунодефіцитами Спроможність виявляти патогенні властивості деяких із цих мікроорганізмів відкрита тільки в останнє десятиліття У закордонній літературі за 1994-2000 роки з'явилася невелика КІЛЬКІСТЬ даних про новий патогенний вид А иппае, що викликає інфекції сечових шляхів, ендокардити і сепсиси, що часто закінчуються летальним виходом у людей похилого віку і пацієнтів із схильністю Слід зазначити, що інтерес до аерококів зв'язаний не тільки з патогенним видом А иппае Всесторонньо вивчається, як у нашій країні, так і за рубежем, представник нормальної мікрофлори людини - Aerococcus viridans, що має широкий спектр біохімічних активностей Крім того, A viridans вивчається, як суперпродуцент L-альфагліцерофосфат оксидази [2] і L-лактат оксидази[3], у зв'язку з чим розробляються середовища культивування і досліджуються властивості ферментів Відомий штам Aerococcus viridans GK 308 ВНИИА - 1730 (Колекція мікроорганізмів науководослідного інституту антибіотиків, м Москва) Штам Aerococcus viridans GK 308 - ВНИИА № 1730 отриманий у результаті добору негемолитическої колонії на 3%-ном кров'яному мясопептонном агарі серед колоній природного розсіву дикого типу Aerococcus viridans 3 відібраної негемолитическої колонії отримана чиста культура при и пересіванні на мясо-пептоновии агар, що містить 10% кінської сироватки Штам Aerococcus viridans GK 308 депонований у колекції мікроорганізмів НДІ антибіотиків (м Москва) під номером 1730 Штам має характерні властивості Морфологічні ознаки Полиморфне Основні структури - коки подовженої овоідної форми, грам-позитивні, нерухомі При електронномікроскопічному дослідженні видні НІЖНІ капсули й усередині кліток великі включення неправильної форми При вирощуванні на середовищах, збагачених кінською сироваткою, клітки однорідне витягнуті і не відрізняються за поліморфозом При вирощуванні штаму на м'ясо-пептоновому агарі і середовищах, збіднених білком, клітки відрізняються значним поліморфозом змінюється форма кліток, їхнє розташування Клітки здобувають неправильну кокоподібну форму, овоідну, гантелеподібну, булавоподібну, зернисту форму Клітки можуть розташовуватися безладно, скупченнями, у виді "частоколу", "розеток", можуть розташовуватися по кільцю Розмноження поперечний розподіл, дроблення Культуральні властивості Скудно росте на м'ясо-пептоновому агарі у виді дрібних (0,5-1,0мм у діаметрі) плоских безбарвних колоній круглої форми, щільної консистенції Поверхня суха, краї рівні згладжені до поверхні середовища Структура гомогенна чи зерниста Спостерігається вростання в середовище Добре росте на м'ясо-пептоновому агарі з додаванням 10% кінської сироватки з формуванням ізольованих, чи колоній, що зливаються, розміром ю ю 52151 2-3 мм у діаметрі, круглої форми, слизуватої консистенції, блискучі Добре росте на м'ясо-пептоновому агарі з додаванням 0,2% лізоциму Характеристика росту така ж, як на м'ясо-пептоновому агарі з додаванням кінської сироватки На 3%-ному кров'яному м'ясо-пептоновому агарі ріст убогий без прояву гемолізу і зміни кольору навколишнього середовища Телуристий калій, доданий у м'ясо-пептоновий агар у концентраціях 0,01-0,05%, не гнітить ріст штаму Селенисто-кислий натрій, доданий у середовище в концентрації 0,05%, придушує ріст штаму При рості в м'ясо-пептоновому бульйоні з додаванням 10% кінської сироватки штам формує придонний і пристінковий осад з одночасним гомогенним помутнінням середовища Штам добре зберігається на твердих живильних середовищах м'ясо-пептоновому агарі, м'ясопептоновому агарі з 10% лоиадиної сироватки і ВІДПОВІДНИХ рідких живильних у середовищах плин 2-3 мес при 4°С Штам добре зберігається в ліофільно-висушеному стані, не утрачаючи своєї життєздатності, по наявним даним, протягом 6 років ФІЗІОЛОГІЧНІ І біохімічні ознаки Як джерела вуглецю штам утилізує глюкозу, арабинізу, рамнозу, сорбіт, лактозу, інозит, ксилозу, дульцит, маніт, сахарозу Не утилізує мальтозу ДНК штаму містить 35-42% Г+Ц Немає цитохром-оксидазної системи і гемвміщующих каталази і пероксидази Добре відновлює телур з телуристого калію і не відновлює селенів із селенисто-кислого натрію Оптимальна температура росту 37°С, температурний інтервал росту 20-40°С, час росту 20-24ч (залежить від виду живильного середовища) Перекис водню не продукує Відношення до антибіотиків резистентне до стрептоміцину - мінімальна гнітюча концентрація антибіотика (МІК) дорівнює 61,44мкг/мол, до лізоциму (МІК - 3000мкг/мол), диоксидину (МІК - 500мкг/мол), димексиду (МІК 3000мкг/мол) До інших препаратів чуттєвий МІНЛИВІСТЬ Штам має підвищену МІНЛИВІСТЬ морфології кліток при вирощуванні на живильних , середовищах збіднених білком Недоліком штаму A vindans GK 308 є повна відсутність антагоністичної активності у відношенні тест-культур мікроорганізмів Завданням винаходу було одержання культу ри Aerococcus vindans с підвищеною антагоністичною активністю у відношенні тест-культур мікроорганізмів Новий штам Aerococcus vindans 167 був виділений із грудного молока По своїх морфологічних, фізіологічних і біохімічних властивостях цілком відповідає представникам роду Aerococcus виду vmdans, а також має антагоністичну активність у відношенні різних штамів мікроорганізмів Культурально-морфолопчні та фізюлого-бюхімічні особливості штаму Aerococcus vmdans 167 - представник мікрофлори організму людини Він відносяться до другого відділу грампозитивних субактерій, що мають клітинну стінку, чи Furmicutes Входити в 17у групу грампозитивних коків, що містить роди Aerococcus, Coprococcus, Demobacter, Demococcus, Enterococcus, Gemmella, Lactococcus, Leuconostoc, Mannococcus, Mehssococcus, Micrococcus, Pediococcus, Peptostreptococcus, Planococcus, RummococcHS, Saccharococcus, Salmicoccus, Sarcma, Staphylococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Tnchococcus, Vagococcus На основі 16S ррнк секвеніровання, біохімічного і жирно-кислотного аналізу, у результаті дослідження фенотипичної і генетичної кревності аерокок-подібних мікроорганізмів, виділених від людини, диференціювали три види - A vmdans, A unnae і A chnstensemi sp nov , ізольований із піхви людини Клітини Aerococcus vmdans 167 мають нерухомі кулясті клітки діаметром 1,0-2,0мкм, у мазках з культур, вирощених на рідких середовищах, розташовуються тетрадами Факультативні анаероби, але краще ростуть у мікроаерофільних умовах Утворять дрібні колони, викликаючи позеленіння кров'яного агару Хемоорганотрофи з окисним метаболізмом, вуглеводи ферментують з утворенням кислоти Каталазо-негативні чи слегка-позитивні Желатин не розріджують, нітрати не відновлюють Температурний оптимум 37 °С (також ростуть при 10°С, але не при 45°С), Принципи виділення аерококків аналогічні таким при індикації стрептококових інфекцій, бактерії утворять білувато-сірі колони, сформовані велика и коками, зібраними в чи зошиті парі Подібно до ентерококків, смороду здатні рости на середовищах, що містять 6,5% NaCI, але не ростуть при 10°С, а також чуттєві до бацитрацину У таблиці 1 наведена характеристика штаму Aerococcus vmdans 167 Таблиця 1 Характеристика штаму Aerococcus vmdans 167 Властивості штаму Морфологія клітин при рості на м'ясо-пептоном агарі (МПА) Морфологія клітин МПА з 10% кінської сироватки Характер росту на МПА МПА з 1 0% кінської сироватки МПА (м'ясо-пептоновий бульйон) Aerococcus vindans 1 67 Коки, що розташовуються тетрадами і скупченнями, неправильної форми, грампозитивні Морфологія та ж Ріст гарний, колонії (1-2мм у діаметрі) з рівними краями, опуклі, що не зливаються Ріст убогий Дрібні крапкові колонії Ріст гарний у виді пристінкового і придонного осаду 52151 Продовження табл 1 Властивості штаму МПА з 0,05% селенистокислого натрію МПА з 0,01% телуристого калію МПА з 0,05% телуристого калію МПА з 3% крові Здатність рости в присутності 40% жовчі при рН 9,6 при 45°С СТІЙКІСТЬ ДО витримування при 60°С ЗО хв у 1 5%-ном розчині Н2О2 Антибіотики Пеніцилін Оксацилін Метицилін Стрептоміцин Лізоцим Бікліноциклін Карбеніцилін Целоспор Кефлін Цефалотін ПОЛІМІКСІН Рифампщин Нітроксолін Грамурин Дюксидин Невіграмон Димексид Хіноксидин Аскорбінова кислота Борна кислота Хлорамін Відновлення 1%-ний метиленової сині в молоці Желатина Гідроліз Аргініну Крохмалю Утилізація вуглеводів Арабшоза Рамноза Інозит Ксилоза Сорбіт Дульцит Глюкоза Лактоза Мальтоза Маніт Сахароза Зміст Г+Ц В ДНК штамів % Отже, підводячи підсумки можна дати наступну характеристику штаму Aerococcus vindans №167 МОРФОЛОГІЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ Грампопозитивні коки, нерухомі, 1-2мкм у діаметрі, що розташовуються парами, чи нерегулярними скупченнями Клітинна стінка складається з Aerococcus vindans 1 67 Ріст гарний, великі (2-Змм у діаметрі) колонії червоного кольору Ріст гарний, колонії середнього розміру (2-Змм у діаметрі), безбарвні Ріст відсутній Ріст рясний Великі колонії (2-Змм у діаметрі), що зеленять кров'яний агар Ріст Ріст Ріст відсутній Стійкий СТІЙКИЙ Мінімальна інгібуюча концентрація (мкг/мл) 0,12 0,12 0,12 3,84 1,92 0,12 3,84 3,84 1,92 1,92 30,72 1,92 1,92 1000 1000 30,72 750 500,0 1000 4000 500,0 Немає не розріджує Не пдролізує Не пдролізує + + + + + + + + + + 30-42 двох електронощильних і одного менш щільного проміжного шару Товщина цитоплазматичної мембрани 200-400А Цитоплазма кліток має гетерогенний характер Вона заповнена дрібними гранулами, полірибосомами, сконцентрованими навколо мезосом чи ядерних утворень КУЛЬТУРАЛЬНИ ВЛАСТИВОСТІ 52151 Колонії аерококів на щільному живильному агарі круглі, 0,5-1,0 мм у діаметрі, напівпрозорі, білі чи сірі, ІНОДІ бусинкоподібні На кров'яному агарі колонії аерококів мають великі розміри, оточені зоною позеленіння, можливо, у результаті дії лактат-оксидази У живильному бульйоні при росту утворюється гомогенне помутніння, що має тенденцію перетворюватися в зернистий осад Установлено залежність росту аерококів від наявності в середовищі біотину, пантотеновій і НІКОТИНОВІЙ кислот Штам не потребує для свого росту вітаміни групи "В" тіаміні, рибофлавіні, пиридоксине, фолиєвої і флавонової кислотах Tween-80 заміняє потребу в біотині Для росту аерококів вимагаються екзогенні пурини Гуанін і ксантин взаємозамінні з аденіном Штам не має потребу в екзогенних пиримидинах Потреба в амінокислотах варіабельна Потреба для росту в біотині, НІКОТИНОВІЙ, пантотеновій кислотах, пуринах і незалежність від змісту в середовищі від вітамінів групи "В", відрізняє аерококки від інших грампозитивних коків, наприклад, педиококків, що бідують у фолиєвої кислоті, чи стрептококів у тіаміні БІОХІМІЧНА АКТИВНІСТЬ При культивуванні на молоці з 1,0% метиленовим синьої не відновлюють останній, підкисляють молоко при відсутності згортання, желатину не розріджують, аргінін, крохмаль, ескулін не пдролізують Аерококи продукують кислоту, але не газ, при культивуванні на середовищах із глюкозою, мальтозою, лактозою, манітолом, сахарозою Ацетоин не утворять, рафинозу не зброджують, каталазу не продукують, коагулазу не утворять При культивуванні в глюкозному (1%) бульйоні кінцеве рН 5,1-5,8 ріст мікроаерофільний При аеробному росту продукують пероксид водню Каталазна активність аерококів може мати негемшовий характер Ае-рококі містять фермент, що захищає їх від супероксидних радикалів - супероксидну дисмутазу, кофактором якої є марганець По киснево СТІЙКОСТІ ае-рококі займають друге місце після S faecahs і знаходяться перед Е сом Максимальна продукція перекису водню в культур аерококів відзначається в ранній період логарифмічної фази культури У аерококів - сильних продуцентів пероксиду водню стаціонарна фаза розвитку культури нетривала Відзначається їхня висока чутливість до антибіотиків 8 ХІМІЧНИЙ СКЛАД Клітинна стінка аерококків містить глюкозу, галактозу, галактозамин і не містить рамнозу, гліцерол чи рибитол Визначено однаковий зміст Г+Ц пар у ДНК аерококів і педиококів, рівне 41-43% Зміст Г+Ц пар у ДНК аеро-коків коливалося в межах 39,5-42,0% В аерококів, виділених із грудного молока, зміст Г+Ц пара була 39,9-42,0%, з коров'ячого 39,5-41,6 Антагоністичну активність штаму Aerococcus vindans №167 перевіряють у відношенні 9 тестштамів методом штриха на щільному живильному у середовищі чашці Петри Ампулу з культурою розводять 0,9% розчином натрію хлориду, з розрахунку змісту 2 108 аерококів у 1мл і засівають штрихом по діаметрі чашки з МПА, що містить 1% глюкози і 0,4 мг/мл калію йодиду Після інкубації ПОСІВІВ у термостаті при температурі (36±1)°С в 48 годин перпендикулярно вирослій культурі аерококів підсівають петлею Генле того ж діаметра культуру тест-штамів Після інкубації при температурі (36±1)°С 24 години зони затримки росту тесткультури вимірюють від краю штриха до початку росту тест-культури Зони гноблення росту тест-штамів повинні бути не менш 5мм для Pseudomonas aerugmosa 1312 і не менш 10 мм для всіх інших культур Тест-штам и Культури тест-штамів одержують з ДІСК їм Л А Тарасевіча Добові культури тест-штамів Staphylococcus aureus 209 р, Proteus vulgans 401, Proteus mirabihs H 2091, Klebsiella pheumomae 320, Pseudomonas aerugmosa 1312, Shigella sonnei, Shigella flexnen 1046, Salmonella typhimunum 5710, Vibrio Nag p 6078, що виросли протягом 24 годин на скошеному МПА, змивають 0,9% розчином натрію хлориду і готують мікробну суспензію 5 Од стандарту (ОСО 42-28-59-85) Продукти, що синтезуються штамом показане на схемі, яку наведено на фіг креслення Можливість одержання штаму підтверджуються наступними відомостями про депонування штаму Штам Aerococcus vindans 167 (колекція мікроорганізмів філії Національного Депозитарію патогених для людини мікроорганізмів на базі Харківського інституту мікробіологи й імунологи їм II Мечникова - інв №1006 від 15 лютого 2002 р) 52151 Aerococcus Інгібітори протеолітичних ферментів 10 v i r i d a n s 167 Лактатоксидаза KJ-пвроксидаэа ПВК (гар о в шо градна кислота) OJ-гшгошдид в середовищах, утримуючих шанс ті речовини Суігеракскд-дісмутвза GSH-пероксидазй GSH-peDyicrasa Глутаткон-Sтрансфероза ФІГ. ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71