Штам васіllus рuміlus “вікторія” для профілактики і лікування дифтерії

Винахід відноситься до медицини, зокрема до мікробіології і може бути використаний в промисловому випуску препарату для профілактики і лікування дифтерії. Рівень техніки: запропонований штам мікроорганізму новий і в науково-технічній, патентній літературі не описаний. Штам зарегістрований в депозитарії Інституту мікробіології ім. Д.К. Заботного під номером ІВМ-В 7009 від 20.02.97. Аналог застосування: відомий спосіб співіснування мікроорганізмів, як антагоністичний, коли одні мікроорганізми подавляють ріст і розвиток інших [Альдшуллер М.А., Блинова Л.П., Батуро А.П, Обнаружение штаммов антагонистов у представителей родов Bacillus и Hafnia. M., НИИ вакцын и сывороток им. Мечникова РАМН, 1993, с. 22-23]. В якості прототипу використана дія непатогенних мікроорганізмів з патогенними, а також колонізації слизової оболонки, наприклад кишківника препаратами біфікол, біфідумбактерін [Костюкова Н.К., Начальный этап инфекционного процесса - колонизация и пути ее предотвращения. М., НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи, АМН. - ЖМЭИ. 1989, №9, с. 103-109./Чернышева H.A., Мельникова K.M., Финкель М.П., Изотова З.Б. Опыт применения сухого препарата бифидумбактерина новорожденным группы риска с целью профилактики ОКЗ. - ЖМЭИ, 1994, №2, с. 37-40]. Недоліком способу являється неможливість застосування його для профілактики і лікування дифтерії. Суттєві відмінності, в яких закладений технічний результат полягають у тому, що у людей, які мали контакт з хворими на дифтерію і не захворіли, а також у безсимптомних бактеріоносіїв з напруженістю імунітету до дифтерії 0, 1:20, 1:40 в обох групах виділений непатогенний штам 921, грам-позитивна спорова паличка, царства Procaryotae сімейства Bacіllaceae, рід Bacillus, вид Bacillus pamilus, який лізує вегетативні форми corynebacterіum diphtheriae (c.d.) на 99% на 3 день, подавляє ріст на 100% при одночасному нанесенні штамів на живильне середовище і (або) нанесенні c.d. на його вегетативні форми при одинаковому 1×109 співвідношенні концентрацій мікроорганізмів. Штам може бути ліо філізований і застосований в промисловому випуску препарату для профілактики і лікування дифтерії. Шлях отримання штаму "Вікторія": у здорових людей які мали контакт з хворими на дифтерію, але не захворіли, або безсимптомних бактеріоносіїв брався посів з ротоглотки сухим ватним тампоном (протоколи №3615 від 21.09.96, №4898 від 29.11.96), мікроорганізми наносилися на живильне середовище КТА, проводилася їх інкубація при температурі 37°С, на протязі 24 год, з послідуючим пересівом на середовище МП А. Веге тативні форми визначалися ті, які мали Інкубацію 13 год. На чашці Петрі культура виглядає слідуюче: плоскі, темно-сірі колонії з чорним центром, піднятими краями, слизистої консистенції, розмірами 0,5-1,5 мм. При мікроскопічному обстеженні: культура через 24 год. грам-позитивна, через 48 год. позитивнонегативна (окраска по Граму), ширина 1-1,5, довжина 3-5 мкм. Глюкозу розщеплює до кислоти без газу, гідроліз крохмалю від'ємний, каталаза позитивна, реакція з яєчним жовтком - від'ємна. Розташування спор - центральне, яскравої роздутості, спорангію немає, рухомість позитивна, ріст на агарі Сабуро - позитивний. Патогенність відсутня, ти тр антитіл у хазяїна до аутоштаму = 0. Антибіотикограма: гентаміцин - 16 мм, левоміцетин - 14 мм, поліміксін - 10 мм, канаміцин - 18 мм, Бпеніцилін - 6 мм, ампіцилін - 6 мм, оксацилін - 6 мм. тетрациклін - 14 мм, ерітроміцин - 10 мм, цефалотін - 14 мм. Результати експериментальних досліджень. Дослід 1. В 5 пробірок одночасно вносилися: в 1, 2, 3 пробірки по 2,0 мл суспензії c.d. і штаму "Вікторія" в одинаковій концентрації 1×109 мікробних тіл, в 4 пробірку вносили 2,0 мл суспензії c.d. в концентрації 1×109 мікробних тіл, до якого добавляли 2,0 мл ізотонічного розчину натрію хлориду, в 5 пробірку вносили 2,0, мл суспензії штаму "Вікторія" в концентрації 1×10 мікробних тіл, до якого добавляли 2,0 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Вказані пробірки з досліджуваними штамами витримували в термостаті 7 діб, при температурі 37°С. Починаючи з першої доби, кожний день з досліджуваних пробірок робився висів по Голду на середовище КТА, петлею 6мм в діаметрі. Висіяна культура інкубувалася в термостаті 24 год при температурі 37°С. Проводилася якісна і кількісна оцінка еталонного штаму с.d., який був у контакті зі штамом "Вікторія", і контрольних штамів. Визначалася токсиганність в реакції преципітації в агарі. Результати дослідів наведені в табл. 1. На 3 день з початку дослідження штам "Вікторія" подавляє ріст на 99%, а на 5 день - 100%. Дослід 2. На чашку ПетрІ з середовищем МПА в луночки діаметром 5 мм, вносили 0,1 мл суспензії штаму "Вікторія" в концентраціях від 1×105 до 3×109 мікробних тіл. Після 2 годин інкубації в термостаті при температурі 37°С, чашка зверху заливалася другим шаром середовища КТА, товщиною 4-5мм і після застивання агару проводився посів газоном суспензії, в концентрації 1×109 мікробних тіл. Чашки витримувалися в термостаті на протязі 24 год, при температурі 37°С. Оцінка результатів досліду 2 наведена в табл. 2. Дослід 3. На чашку ПетрІ з середовищем КТА наносили суспензію штаму "Вікторія" петлею в діаметрі 6 мм, 0,01 мл, концентрацією 1×109 мікробних тіл. Перпендикулярно до вказаного посіву наносили суспензію еталонного штаму c.d. тією ж самою петлею (діаметр 6 мм, після стерилізації), 0,01 мл, концентрацією 1×109 мікробних тіл. Культури розміщували в термостаті на 24 год при температурі 37°С. При оцінці результатів зроблено висновок, що оптимальна концентрація, при якій спостерігається затримка росту 1×109. Мал. № 1. Результат одночасного посіву через 24 години. Виділена культура ліофілізована у вакуумі 5×102 мм рт.ст.. при температурі +40°С. на протязі 12 год, в дозі 1×109 мікробних тіл. Ліофілізат розводився ізотонічним розчином натрію хлориду в кількості 1,0 мл. При дослідженні виявлено (див. дослід 2). Таким чином, культура "Вікторія" подавляє ріст і проводить лізис еталонного штаму Carynebacterium diphtheriae, в дозі 1×109 мікробних тіл, може бути ліофілізована і використана в промислових умовах, для вироблення препарату для лікування і профілактики дифтерії.