Середовище для підвищення активності проліферації клітин різних типів

Середовище для підвищення активності проліферації клітин різних типів, яке містить в своєму складі неорганічні солі, амінокислоти, вітаміни та інші біологічно активні речовини, яке відрізняється тим, що до його складу додатково вводять сукцинат натрію в кількості 0,2-0,4 г/дм3 і проводять культивування впродовж 72 годин при такому співвідношенні чинників: Неорганічні солі, г/дм3 СаС12•2Н2О 0,2 Fe(NO3)3•9H2O 0,00072 MgSO4 (безводна) 0,09767 KС1 0,4 Na ацетат (безводний) 0,05 NaHCO3 2,2 NaCl 6,8 NaH2PO4 (безводна) 0,122 Амінокислоти, г/дм3 L-аланін 0,025 L-аргінін 0,07•НС1 L-аспарагінова кислота 0,03 L-цистин•НС1•Н2О 0,00011 L-цистеїн•2НС1 0,026 L-глутамінова кислота 0,0668 L-глутамін 0,1 Гліцин 0,05 L-гістидин НС1•Н2О 0,02188 Гідрокси-L-пролін 0,01 L-ізолейцин 0,02 L-лейцин 0,06 L-лізин 0,07•НС1 L-метіонін 0,015 2 (19) 1 3 54749 Корисна модель відноситься до галузі клітинної біотехнології, зокрема, активації мітотичного поділу клітин, а саме, до середовища для культивування клітин in vitro і може бути використаний у біотехнологічних центрах, в господарствах різних організаційно-правових форм для культивування культур клітин різних типів і, зокрема, культур клітин яйцепроводів та ембріональних фібробластів плодів. Відомі стандартні поживні середовища, які випускаються спеціалізованими фірмами. Основу поживних середовищ складають сольові розчини. Мінеральні компоненти у цих розчинах підібрані так, що розчин виконує буферні функції, підтримуючи постійний кислотно-лужний баланс середовища в процесі культивування. Для приготування поживних середовищ використовуються сольові розчини Ерла і Хенкса, додаючи компоненти біологічного походження (іноді плазма, сироватка, тканинні екстракти і т.д.) [Myung-Sook Han and Koji Niwa, Effect of BSA and Fetal Bovine Serum in culture medium on development of rat embryos // Journal of Reproduction and Development. 2003. –Vol.49. –№3. –P.235-242]. Недоліком застосування даних середовищ є те, що при роботі з культурами клітин їх вибирають емпірично. Відоме середовище для культивування клітин, що сприяють активації проліферативних процесів за рахунок підвищення інтенсивності поділу клітин, активації їх життєдіяльності та збільшення функціональної здатності в основному базується на додаванні фетальної сироватки, яка містить фактори росту [http://www.worldlingo.com/ma/enwiki/en/Fetal_bovm e_serum/1]. Недоліком цього середовища – є відсутність в його складі енергетичних субстратів, які здатні інтенсифікувати енергетичні процеси в умовах гіпоксії клітин при їх декріоконсервуванні. Найбільш близьким по суті до середовища, що заявляється є середовище 199(ТСМ-199) [Morgan, J.F., Campbell, E., and Morton, H.J. The Nutrition of Animal Tissues Cultivated In Vitro. I. A Survey of Natural Materials as Supplements to Synthetic Medium. J.N.C.I., 16:2,557-567 (1955). wvwv.sigmaaldrich.com], яке містить: Неорганічні солі, г/дм3 СаСl2•2Н2О Fe(NO3)3•9H2O MgSO4 (безводна) КСl Na ацетат (безводний) NaHCO3 NaCl NaH2PO4 (безводна) Амінокислоти, г/дм3 L-аланін L-аргінін L-аспарагінова кислота 0,2 0,00072 0,09767 0,4 0,05 2,2 6,8 0,122 0,025 0,07•НСl 0,03 4 L-Цистин•НСl•Н2О 0,00011 L-цистеїн•2НСl 0,026 L-глутамшової кислота 0,0668 L-глютамін 0,1 Гліцин 0,05 L-гістидин НСl•Н2О 0,02188 Гідрокси-L-проліну 0,01 L-ізолейцин 0,02 L-лейцин 0,06 L-лізин 0,07•НСl L-метіонін 0,015 L-фенілаланін 0,025 L-проліну 0,04 L-серин 0,025 L-треонін 0,03 L-триптофан 0,01 L-тирозин 2Na•2Н2О 0,05766 L-Валін 0,025 Вітаміни, г/дм3 Аскорбінова кислота • Na 0,0000566 Д-біотин 0,00001 Кальциферол 0,0001 Холін хлорид 0,0005 Фолієва Менадіона (натрію бісульфіт) 0,000016 міо-Інозитол 0,00005 Ніацинамід 0,000025 Нікотинова кислота 0,000025 n-аміно бензойної кислоти 0,00005 D-пантотенова кислота•SCa 0,00001 Піридоксаль•НСl 0,000025 Піридоксин НСl 0,000025 Ретинолу ацетату 0,00014 Рибофлавін 0,00001 DL-a-токоферолу - фосфат•Na 0,00001 Тіамін НСl 0,00001 Інші біологічно активні речовини, г/дм3 Аденін сульфат 0,01 Аденозин трифосфат•2Na 0,001 Аденозин монофосфат•Na 0.0002385 Холестерин 0,0002 Дезоксирибоза 0,0005 Глюкоза 1,0 Глутатіон 0,00005 Гуанін•НСl 0,0003 Гіпоксантин 0,0003 Фенол Червоний•Na 0,0213 Твін-80 0,02 Рибоза 0,0005 Тимін 0,0003 Урацил 0,0003 Ксантин•Na 0,000344. Недоліком найближчого аналога є, відсутність в його складі речовин, що забезпечують зростання проліферативних процесів клітин в умовах гіпоксії при порушенні НАД-залежного дихання клітин за умов їх декріоконсервування. Заявлене нами середовище усуває недоліки найближчого аналогу і забезпечує полііндукторну дію на проліферативні процеси в клітинах за рахунок наявності в заявленому середовищі 5 додатково введеної біологічно активної речовини солі бурштинової кислоти (сукцинату натрію). В основу корисної моделі поставлено завдання розробити ефективний склад середовища для підвищення активності проліферації клітин яйцепроводів та ембріональних фібробластів плодів поза організмом, який забезпечував би умови виживання клітин подібні до відповідних in vivo, їх проліферацію та диференціювання. Технічний результат досягається шляхом додаткового внесення до складу основного середовища ТСМ-199, яке містить неорганічні солі, амінокислоти, вітаміни і інші біологічно активні речовини – сукцинату натрію в дозі 0,2-0,4г на 1дм3 і культивування впродовж 72 годин. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак корисної моделі, яка з'являється і технічним результатом, якого можна досягнути є наступним: без солей бурштинової кислоти (сукцинатів) неможливо активізувати енергосинтезуючу функцію мітохондрій в умовах гіпоксії при порушенні НАД-залежного дихання клітин, стимулювати синтез відновних еквівалентів у клітин, який супроводжується швидким ресинтезом АТФ, покращувати оксигенацію клітин і, як наслідок, підвищувати індекс проліферації клітин. При застосуванні солей бурштинової кислоти можна виділити дві групи ефектів: а) пряму дію бурштинової кислоти на клітинний метаболізм; б) вплив бурштинової кислоти на транспорт вільного кисню в тканини. При проведенні патентно-інформаційного пошуку заявником і авторами корисної моделі знайдено технічне рішення, яке містить найбільшу кількість ознак, спільних із заявленим середовищем: наявність в середовищі неорганічних солей, амінокислот, вітамінів та інших біологічно активних речовин. Однак, наявність зазначених, спільних з найближчим аналогом суттєвих ознак, недостатньо для одержання технічного результату, який забезпечує заявлене середовище. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю співпадали з заявленим технічним рішенням - не виявлено. Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію винаходу (корисної моделі) "новизна". В патентній науково-технічній інформації не знайдено технічних рішень, в яких були б описані відомості про ознаки, що відрізняють заявлену корисну модель від найближчого аналога і забезпечують досягнення технічного результату введення в середовище солі бурштинової кислоти (сукцинату натрію) для зростання проліферативних процесів різних типів клітин. Отже, заявлене технічне рішення не впливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про його відповідність критерію винаходу (корисної моделі) - "винахідницький рівень". Корисна модель може бути застосована у біотехнологічних центрах, в господарствах різних організаційно-правових форм для культивування 54749 6 різних типів клітин: культури клітин яйцепроводів та культури ембріональних фібробластів плодів. Середовище готують: роблять наважку сукцинату натрію - 0,2-0,4г додають його до 1дм3 основного середовища 199 (ТСМ-199), ретельно перемішують, вимірюють рН і при необхідності доводять його до 7,0-7,2. Одержання культури клітин яйцепроводів Яйцепроводи подрібнювали ножицями на фрагменти 0,5-1мм, Отриману подрібнену масу яйцепроводів гомогенізували в скляному гомогенізаторі у середовищі ТСМ-199 у співвідношенні 1:1. Суспензію гомогенізованих клітин фільтрували через 4 шари марлі і центрифугували при режимі 1000об/хв. протягом 10хв. Супернатант зливали, а центрифугат промивали середовищем ТСМ-199 (рН 7,0-7,2). Після промивання суспензію клітин знову центрифугували з метою відокремлення зруйнованих та мертвих клітин у тому ж режимі. Супернатант видаляли, до центрифугату додавали 0,5% трипсин для запобігання адгезії клітин у співвідношенні об'ємів 1:1 і ставили на культивування у термостат з 5% СО2 при максимальній вологості за температури 37°С впродовж 25хв. Суспензію клітин після трипсинізації центрифугували третій раз і видаляли супернатант з трипсином. До центрифужної пробірки додавали 2см3 середовища ТСМ-199 і центрифугували при 1000об/хв -10хв. Супернатант видаляли. До 3 центрифугату додавали ще 2см ТСМ-199 і центрифугували 2хв при 1000об/хв для відокремлення ізольованих клітин від зайвих конгломератів, що не піддалися трипсинізації. Супернатант – це первинна культура клітин, обережно відбирали і поміщали у теплі пробірки. Після цього визначали концентрацію клітин за допомогою камери Горяєва. Підрахунок клітин проводили у п'яти великих квадратах (n) за 3 формулою: "n"×12,5×1000=кількість клітин в 1см . Одержання культури ембріональних фібробластів плодів Виділені в асептичних умовах плоди мишей клали в чашки Петрі об'ємом 10см3 із стерильним фосфатно-сольовим буфером (PBS). В кожного плода видаляли внутрішні органи кінцівки та верхню частину голови з мозком залишаючи нижню щелепу. Залишки плодів переносили в 50см3 конічну колбу із стерильним (PBS). Відмивали 2-3 рази стерильним середовищем без сироватки після чого переносили у чашку Петрі та подрібнювали ножицями. Подрібнені плоди переносили в 50см3 флакони (матрасики) та додавали по 10см3 трипсин/ЕДТА. Додавали скляні бусинки і струшували. Флакони закривали та інкубували 30хв за температури 37°С. Знову додавали 10см3 трипсин/ЕДТА і продовжували інкубувати ще 30хв. Повторювали цей етап до кінцевого об'єму 30см3. Після інкубування поміщали суспензію в новий флакон, в якому було середовище з 10% фетальної сироватки. Отриману суміш центрифугували при 1000об/хв 5хв. Осад розводили в 50см3 свіжого ТСМ-199 з сироваткою і ставили на культивування. 7 54749 Ефективність заявленого середовища і його переваги перед найближчим аналогом підтверджені прикладами конкретного виконання на культурі клітин яйцепроводів корів та ембріонального фібробласта. Приклад з мінімальним значенням. Сукцинат натрію 0,2 г/дм3 Неорганічні солі, г/дм СаСl2•2Н2О 0,2 Fe(NO3)3•9H2O 0,00072 MgSO4 (безводна) 0,09767 КСl 0,4 Na ацетат (безводний) 0,05 NaHCO3 2,2 NaCl 6,8 NaH2PO4 (безводна) 0,122 Амінокислоти, г/дм3 L-аланін 0,025 L-аргінін 0,07•НСl L-аспарагінова кислота 0,03 L-Цистин•НСl•Н2О 0,00011 L-цистеїн•2НСl 0,026 L-глутамінової їсислоти 0,0668 L-глютамін 0,1 Гліцин 0,05 L-гістидин НСl•Н2О 0,02188 Гідрокси-L-проліну 0,01 L-ізолейцин 0,02 L-лейцин 0,06 L-лізин 0,07•НСl L-метіонін 0,015 L-фенілаланін 0,025 L-проліну 0,04 L-серин 0,025 L-треонін 0,03 L-триптофан 0,01 L-тирозин 2Na•2Н2О 0,05766 L-Валін 0,025 Вітаміни, г/дм3 Аскорбінова кислота • Na 0,0000566 Д-біотин 0,00001 Кальциферол 0,0001 8 Холін хлорид 0,0005 Фолієва Менадіона (натрію бісульфіт) 0,000016 міо-Iнозитол 0,00005 Ніацинамід 0,000025 Нікотинова кислота 0,000025 n-аміно бензойної кислоти 0,00005 D-пантотенова кислота•SCa 0,00001 Піридоксаль•НСl 0,000025 Піридоксин НСl 0,000025 Ретинолу ацетату 0,00014 Рибофлавін 0,00001 DL-α-токоферолу - фосфат•Na 0,00001 Тіамін НС1 0,00001 Інші біологічно активні речовини, г/дм3 Аденін сульфат 0,01 Аденозин трифосфат•2Na 0,001 Аденозин монофосфат•Na 0,0002385 Холестерин 0,0002 Дезоксирибоза 0,0005 Глюкоза 1,0 Глутатіон 0,00005 Гуанін•НСl 0,0003 Гіпоксантин 0,0003 Фенол Червоний•Na 0,0213 Твін-80 0,02 Рибоза 0,0005 Тимін 0,0003 Урацил 0,0003 Ксантин•Na 0,000340. Приклад з середнім значенням. Проводять аналогічно прикладу 1 але беруть сукцинату натрію в кількості 0,3г/дм3 Приклад з максимальним значенням. Проводять аналогічно прикладу 1 але беруть сукцинату натрію в кількості 0,4г/дм3 В результаті проведених науково-дослідних робіт були одержані дані динаміки активності проліферації декріоконсервованих клітин яйцепроводів впродовж 72 годин культивування з 3 початковою посівною концентрацією - 0,8млн/см , які представлені в таблиці 1. Таблиця 1 Культивування декріоконсервованих клітин яйцепроводів за умов додавання до основного середовища ТСМ-199 сукцинату натрію, (М±m), n=3 Групи Контроль ТСМ-199 Д1(ТСМ-199+ сукцинат натрію 0,2г/дм3) Р Д2(ТСМ-199+ сукцинат натрію 3 0,4г/дм ) Р Посівна Концентрація клітин концентрація х106/см3 через 24год клітин х106/см3 культивува-ння 0,8 1,5±0,13 Концентрація клітин х106/см3 через 48год культивування 2,6±0,07 Концентрація клітин х106/см3 через 72год культивування 3,6±0,13 0,8 1,9±0,07 0,05 6,2±0,13 0,1 3,4±0,07