Штам бактерій bradyrhizobium japonicum т21-2 (імв в-7322) для одержання бактеріального добрива під сою

Штам бактерій Bradyrhizobium japonicum T21-2 (ІMB В-7322) для одержання бактеріального добрива під сою. (19) (21) u201104725 (22) 18.04.2011 (24) 25.10.2011 (46) 25.10.2011, Бюл.№ 20, 2011 р. (72) КОЦЬ СЕРГІЙ ЯРОСЛАВОВИЧ, ВОРОБЕЙ НАДІЯ АНАТОЛІЇВНА, МАМЕНКО ПАВЛО МИКО 3 При дослідженні штаму, що заявляється, використовували стандартні мікробіологічні, молекулярно-генетичні та фізіологічні методи, а також методики проведення й обліку результатів вегетаційних і польових дослідів. Культурально-морфологічні ознаки: Культура бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum T21-2 - повільнорослі, грамнегативні палички розміром 1,7-3,0×0,5-0,9 мкм. Культура не спороносна, рухлива (монотрих). Бактероїди мають таку ж форму, як і звичайні клітини, проте значно крупніші. Колонії з'являються на 7-8 добу, однотипові, дрібні - 1,5 см, круглі, помірно-випуклі, білуваті, слизисті, з часом розростаються по поверхні агаризованого середовища, але не розтікаються. Штрих на люпиновому агарі помірний, білуватий, пастообразний. Фізіолого-біохімічні ознаки: запропонована культура є мікроаерофілом. Температурний діапазон росту бульбочкових бактерій штаму B.japonicum T21-2: 25-28 °C. Оптимальна температура вирощування - 27 °C. Оптимальне значення pH 6,5-7,0. Культура бактерій В. japonicum T21-2 молоко із лакмусом не пептонізує, желатину не розріднює. Росте на середовищах із амонійними солями і азотнокислим натрієм, має уреазну активність. Не росте на м'ясо-пептонному агарі (МПА), не метаболізує триптофан. Культура бактерій Т21-2 активно використовує у якості джерела вуглецю різні вуглеводи, зокрема, глюкозу, мальтозу, рамному, мелібіозу, арабінозу, манніт із підлуговуванням середовища. Із меншою активністю метаболізує сахарозу, інозит, сорбітол, амігдалин. Відмінним джерелом вуглецю для культури Т21-2 є меляса. Клітковину і крохмаль не засвоює. Має слабкий ріст на картопляному агарі. На відміну від вихідного штаму 646 В.japonicum не засвоює галактозу і ксилозу. Генетичні особливості: прототроф, стійкий до 200 мкг/мл канаміцина сульфату і 800 мкг/мл стрептоміцина сульфату та ряду інших антибіотиків, проте у значно менших концентраціях. Штам непатогенний. У геномі клітин бульбочкових бактерій штаму Т21-2 В.japonicum, присутній фрагмент гену неоміцинфосфотрансферази транспозону Тn5 довжиною 517 н.п. (результати аналізу продуктів полімеразної ланцюгової реакції (ГОІР аналіз) ампліфікації ДНК), що відрізняє його від вихідного (батьківського) штаму 646 В.japonicum і забезпечує стійкість до канаміцину сульфату в концентрації 200 мкг/мл. Штам Т21-2 В.japonicum характеризується підвищеною продукцією екзополісахаридів. Для довгострокового зберігання штаму рекомендовано мінеральне середовище манітнодріжджовий агар (МДА). Культура добре зберігається в пробірках на скошеній поверхні МДА під шаром мінеральної олії при кімнатній температурі або в холодильнику при температурі 4-5 °C на цьому ж середовищі без олії. Рекомендовано пересівати 1-2 рази на рік, додавати в середовище вирощування антибіотик - канаміцина сульфат 200 мкг/мл. Ефективність інокуляції насіння сої запропонованим штамом Т21-2 вивчали у мікровегетацій 64086 4 них, вегетаційних і польових дослідах у порівнянні з застосуванням виробничого 634б, вихідного 646 та Т66 штамів В.japonicum. У мікровегетаційних та вегетаційних умовах рослини вирощували на піщаному субстраті з 0,2 н азоту за Гельрігелем (1 норма відповідає 708 мг Cа(NO3)2×4Н2О на 1 кг піску). Польові досліди проведені в Черкаській області на темно-сірому опідзоленому грунті (вміст гумусу 1,6-2,0 %, азоту 12,1-12,7 фосфору 9,3-12,2, калію 13,1-17,6 мг /100 г ґрунту, pH 5,4-5,7) і в Київській області на сірому лісовому супіщаному ґрунті (вміст гумусу 1,21,5 %, N10,4-12,6, фосфору 8,8-10,1, калію 9,4-10,2 мг/100 г ґрунту, pH 5,9-6,0). Для приготування рідкого бактеріального препарату культуру бульбочкових бактерій В.japonicum T21-2 вирощували на манітнодріжджовому агарі у пробірках при +28 °C протягом 6-7 діб, потім змивали з поверхні агаризованого середовища стерильною водою. Густою суспензію бульбочкових бактерій (20 мл) засівали качалочні колби із манітно-дріжджовим середовищем (350 мл). Культивування проводили протягом 6 діб при температурі 28 °C і постійній аерації середовища вирощування. Бактеріальний титр препарату (рідка форма) повинен дорівнювати не менше 1-1,5 млрд. клітин бульбочкових бактерій штаму Т21-2 в 1 мл препарату. Активність ферменту нітрогенази бактероїдів бульбочок, утворених за участю штаму Т21-2 В.japonicum, визначали за відновленням ацетилену в етилен за методом Харді на газовому хроматографі "Agilent Technologies 6850", Vetwork GC System [Hardy R.W.F., Holsten R.D., Jackson E.K., Bums R.C., 1968]. Досліджували вплив передпосівної інокуляції штамом Т21-2 В.japonicum на формування симбіотичних органів у сої, інтенсивність фіксації атмосферного азоту кореневими бульбочками, ріст вегетативної маси, ризогенез рослин. Інтегральним показником ефективнвості застосування штаму Т21-2 слугував урожай зерна сої і вміст у ньому білка. У польових дослідах у ґрунтово-кліматичних умовах Київської та Черкаської областей інокуляція рослин запропонованим штамом Т21-2 B.japonicum забезпечувала збільшення кількості кореневих бульбочок у сої сорту Аннушка на 35,7 %, сорту Васильківська - на 31,6 %, сорту Мар'яна - на 59,0 % і сорту Колбі - на 21,3 % у порівнянні із застосуванням штаму-стандарту 634б (табл.1-4). При цьому загальна маса бульбочок на 1 рослині збільшувалась на 16,6-47,4 % в залежності від використаного сорту сої (табл. 1-4). Інокуляція сої рекомендованим штамом В.japonicum T21-2 у формі рідкого бактеріального препарату забезпечувала збільшення азотфіксувальної активності в 1,4-1,7 рази порівняно із бактеризацією рослин вихідним 646 і виробничим 634б штамами, як за присутності місцевих рас ризобій у ґрунті так, і за їх відсутності. Отримані показники азотфіксувальної активності і симбіотичної ефективності застосування запропонованого штаму Т21-2 у якості штама-інокулянта сої сортів Аннушка, Васильківська, Мар'яна і Колбі у різних ґру 5 64086 нтово-кліматичних умовах наведені в таблицях 15. У ґрунтово-кліматичних умовах Київської та Черкаської областей бактеризація насіння сої штамом Т21-2 забезпечувала формування симбіотичного апарату, інтенсивність азотфіксації якого на сої сортів Аннушка і Колбі перевищувала в середньому у 1,5 рази, а на сорті сої Васильківська у 2,0 рази варіант із застосуванням штаму Т66. При цьому азотфіксувальна активність кореневих бульбочок у сої сорту Мар'яна, утворених за участю штамів Т21-2 або Т66, суттєво не відрізнялась 6 Збільшення азотфіксувальної активності бульбочок сої супроводжувалося інтенсифікацією вегетативного росту рослин - збільшенням надземної маси та маси коренів (табл.5). У результаті випробування запропонованого штаму Т21-2 В.japonicum в умовах польових дослідів у Черкаській та Київський областях виявлено високу екологічну пластичність та конкурентоздатність запропонованого штаму, про що свідчить активне формування та функціонування бульбочок на коренях рослин-хазяїв за різних ґрунтовокліматичних умов їх вирощування. Таблиця 1 Симбіотичні властивості та урожай зерна сої сорту Аннушка (польові досліди) Урожай, ц/га Середній Штам-інокулянт І II Без інокуляції 21,5±1,2 23,3±0,7 (контроль) Штам-стандарт В.japonicum 23,6±0,8 25,9±1,0 634б В.japonicum 646 22,8±0,9 24,8±1,2 (вихідний) В.japonicum T66 24,5±1,9 23,4±1,5 Запропонований штам 27,7±1,2 28,5±0,7 В.japonicum Т21-2 НІР0,05 1,9 1,8 ± до Азотфіксувальна активність Маса бу- Кількість штамуконтролю (мкмоль льбочок, бульбочок, стандарту С2Н4/(рослину г/рослину шт./рослину ц/га % ц/га % год.)) 22,4 -2,3 -9,4 1,74±0,22 0,19±0,03 10,0±1,0 24,7 2,3 10,7 1,83±0,20 0,24±0,02 14,0±1,0 23,8 1,4 6,2 -0,9 -3,7 2,00±0,30 0,20±0,01 18,0±4,0 23,9 1,5 6,7 -0,8 -3,3 2,04±0,11 0,11±0,08 27,2±2,0 28,1 5,7 25,4 3,4 3,19±0,37 0,28±0,03 19,0±1,0 13,8 Примітка: Тут і в таблицях 2 і 3 - І - польові досліди, проведені в Київській обл., II - польові досліди, проведені в Черкаській обл. Таблиця 2 Симбіотичні властивості та урожай зерна сої сорту Васильківська (польові досліди) Урожай, ц/га Штам-інокулянт І Без інокуляції 25,4±1,7 (контроль) Штам-стандарт В.japonicum 29,5±1,2 634б В.japonicum 646 26,5±1,2 (вихідний) В.japonicum T66 32,1±2,1 Запропонований штам 33,4±1,4 В.japonicum Т212 НІР0,05 2,5 II ± до фаза бутонізація - початок цвітіння штаму- Азотфіксувальна контролю стандарту активність, Маса бу- Кількість Середній (мкмоль льбочок, бульбочок, С2Н4/(рослину г/рослину шт./рослині ц/га % ц/га % год.)) 32,4±1,9 28,9 1,73±0,28 0,30±0,02 11,0±10,0 37,1±1,0 33,3 4,4 15,2 2,04±0,24 0,38±0,03 19,0±1,0 35,3±2,2 30,9 2,0 6,9 -2,4 -7,3 2,42±0,50 0,30±0,02 11,0±1,0 34,5±1,8 33,3 4,4 15,2 0,0 0,0 1,69±0,30 0,40±0,01 14,0±1,0 41,2±1,3 37,3 8,4 29,0 4,0 12,0 3,46±0,21 0,56±0,04 25,0±1,0 -4,7 -12,7 3,2 Таблиця 3 7 64086 8 Симбіотичні властивості та урожай зерна сої сорту Мар'яна (польові досліди) ± до Урожай, ц/га Штам-інокулянт І Без інокуляції (контроль) Штам-стандарт В.japonicum 634б В.japonicum 646 (вихідний) В.japonicum T66 Запропонований штам В.japonicum Т21-2 НІР0,05 II контролю ц/га Середній % ц/га % -2,1 Фаза бутонізація - початок цвітіння Азотфіксувальна активність, Кількість Маса бу(мкмоль бульбочок, льбочок, г С2H4/(рослину шт./рослину год)) штамустандарту -8,8 4,26±0,55 0,27±0,05 25,0±2,0 6,69±0,62 0,33±0,02 22,0±2,0 -1,9 8,32±0,95 0,31±0,05 26,0±4,0 3,1 12,8 12,96±0,92 0,45±0,02 30,0±3,0 3,0 12,4 11,54±0,51 0,44±0,02 35,0±3,0 23,4 21,6 22,5 24,4 24,9 24,6 2,1 9,3 24,1 24,3 24,2 1,7 7,5 -0,6 28,6 27,1 27,8 5,3 23,5 28,2 27,2 27,7 5,2 23,1 2,0 2,0 Таблиця 4 Симбіотичні властивості та урожай зерна сої сорту Колбі (Київська обл.) ± до Фаза - цвітіння Азотфіксувальна активність Кількість Маса бу(мкмоль бульбочок, льбочок, г С2Н4/(рослину шт./рослину год.)) Без інокуляції (контроль) В.japonicum 634б Штам-стандарт В.japonicum 646 (вихідний) В.japonicum T66 Запропонований штам В.japonicum T21-2 НІР0,05 контролю ц/га Штам-інокулянт штамустандарту % ц/га % 30,1±1,7 -2,7 -8,3 0 32,8±1,8 2,7 8,97 3,06±0,34 0,21±0,04 20,6±3,0 32,5±1,9 2,4 7,97 -0,3 -0,9 3,46±0,29 0,13±0,01 9,0±0,0 35,8±2,1 5,7 18,9 3,0 9,1 3,16±0,16 0,12±0,05 16,0±1,0 36,9±2,4 6,8 22,6 4,1 12,5 4,78±0,31 0,28±0,02 25,0±2,0 Середній урожай, ц/га 2,6 Таблиця 5 Показники вегетативної маси рослин сої різних сортів, за інокуляції запропонованим штамом Bradyrhizobium japonicum T21-2 (польові досліди, фаза цвітіння) Штам-інокулянт Без інокуляції Штам-стандарт В.japonicum 634б В.japonicum T66 Запропонований штам В.japonicum T21-2 Черкаська обл., 2009 p. Київська обл.2010 р. сорт Аннушка сорт Васильківська сорт Мар'яна сорт Колбі Надземна Маса ко- Надземна Маса ко- Надземна Маса Надземна Маса комаса, г реня, г маса, г реня, г маса, г кореня, г маса, г реня, г 6,24±0,52 0,80±0,04 13,26±0,80 1,41±0,07 6,26±0,49 1,57±0,09 9,9,10±0,40 0,85±0,02 9,29±0,45 1,16±0,07 14,6±1,39 1,70±0,18 8,47±0,34 2,27±0,11 10,10±1,11 1,69±0,28 10,9±0,85 1,2±0,10 18,35±0,95 2,00±0,10 9,0±0,20 2,10±0,10 11,26±0,60 2,02±0,15 12,1±0,89 1,76±0,13 20,53±1,23 2,30±0,19 10,60±0,36 2,45±0,12 12,65±1,24 2,37±0,50 9 64086 У польових дослідах інокуляція сої сортів Аннушка, Васильківська, Мар'яна та Колбі штамом Т21-2 забезпечила прибавку урожаю зерна відповідно на 5,7 (25,4 %), 8,4 (29,0 %), 5,2 (23,1 %) та 6,8 ц/га (22,6 %) порівняно із неінокульованими рослинами і на 3,4 (13,8 %), 4,0 (12,0 %), 3,0 (12,4 %) та 4,1 ц/га (12,5 %) у порівнянні із інокульованими виробничим штамом 634б. Беззаперечною перевагою передпосівної інокуляції насіння штамом Т21-2 є збільшення урожаю зерна сої сортів Васильківська, Аннушка відповідно на 12,0 і 17,6 % у порівнянні з використанням штаму Т66 B.japonicum. Таким чином, у залежності від використаного сорту і ґрунтово-кліматичних умов вирощування прибавка урожаю зерна сої при інокуляції штамом Т21-2 B.japonicum становила 5,2-8,4 ц/га (22,329,0 %) порівняно із варіантом без інокуляції і 3,04,1 ц/га (12,0-13,8 %) порівняно із бактеризацією штамом-стандартом 634б. Інокуляція ефективними штамами бульбочкових бактерій є одним із засобів підвищення урожайності бобових культур і вмісту в них білка. Рівень вмісту білкових речовин у зернобобових культур - один із головних критеріїв їх господарської цінності. Однак умови вирощування і сортові особливості суттєво впливають на ці показники. За інокуляції запропонованим штамом Т21-2 показник вмісту білка у зерні сої досліджуваних сортів мав 10 тенденцію до збільшення порівняно із рослинами, бактеризованими досліджуваними штамами Т66, 646 та 634б (табл. 6). Отримані результати при випробуванні запропонованого штаму B.japonicum T21-2 у якості штаму-інокулянту на різних сортах сої та у різних ґрунтово-кліматичних умовах свідчать, що цей штам має ряд відчутних переваг порівняно із штамом 634б, а також переважає аналог (за методом отримання) Т66 як за азотфіксувальною активністю, так і ефективністю на ряді сортів сої. Таким чином, польові дослідження ефективності застосування штаму B.japonicum T21-2 як бактеріального добрива при вирощуванні сої сортів Аннушка, Васильківська, Мар'яна і Колбі, проведені в різних ґрунтово-кліматичних умовах Черкаської і Київської областей, виявили беззаперечну його перевагу над штамомстандартом В.japonicum 634б. Використання рідкої форми бактеріального препарату на основі штаму Т21-2 Bradyrhizobium japonicum для інокуляції посівного матеріалу сої збільшує азотфіксувальну активність кореневих бульбочок сої в 1,4-1,7 рази і забезпечує підвищення урожайності зерна на 3,04,1 ц/га (12,0-13,8 %) у порівнянні із штамомстандартом 634б і на 5,2-8,4 ц/га (22,3-29,0 %) порівняно із варіантом без інокуляції у залежності від сорту сої і ґрунтово-кліматичних умов її вирощування. Таблиця 6 Вміст білка у зерні сої, за інокуляції штамами В.japonicum (%, середнє за 3 роки, польові досліди) Варіант досліду Без інокуляції (контроль) Штам-стандарт В.japonicum 634б В.japonicum 646 (вихідний)646 В.japonicum T66 Запропонований штам В.japonicum T21-2 Комп’ютерна верстка А. Рябко Сорт Аннушка скоростиглий 35,0±0,09 Сорт Васильківська Сорт Мар'яна Сорт Колбі сересередньоранній середньостиглий дньостиглий 32,9±0,01 30,3±0,10 32,0±0,09 36,5±0,11 34,4±0,06 33,9±0,05 34,8±0,12 36,2±0,13 37,0±0,12 34,3±0,07 34,2±0,06 32,9±0,07 33,5±0,06 33,8±0,10 34,0±0,13 38,2±0,12 34,9±0,05 34,4±0,06 35,2±0,09 Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601