Спосіб виділення збудника туберкульозу, живильна основа для середовища та спосіб одержання живильного середовища і злаковий біологічний стимулятор росту збудника туберкульозу

Винахід відноситься до медичної та ветеринарної мікробіології і може бути використаний в медичній та ветеринарній практиці. Відомі способи виділення збудника туберкульозу, живильні середовища та способи їх одержання, також стимулятори росту для виділення збудника туберкульозу. Найбільш близьким до заявленого способу виділення збудника туберкульозу на живильному середовищі є спосіб, який передбачає приготування середовища, підготовку патологічного матеріалу, висів патологічного матеріалу на живильне середовище з наступним термостатуванням [1]. Відповідно до нього проводять мікроскопію мазків крові і, згідно гіпотези авторів, можна виявити агроспору, проростання молекули у вигляді стебла, сегментацію стебла, палички Коха. В подальшому зразки обробляють інгібітором і додатково утримують 12-24 години в стимуляторі росту і висівають на поживне середовище. Ріст збудника на цьому середовищі прискорюють, але як недолік слід зазначити, що отримані колонії не характерні, клітини морфологічно змінені, по Ціль-Нельсону не фарбуються, медикаментозна стійкість не визначається і необхідно додатково проводити ідентифікацію отриманих культур та визначити чутливість штаму до лікувальних препаратів. Для підтвердження морфологічних ознак культури пересівають на середовище Левенштейна-Йенсена і через 20 діб отримують характерну кислото-, спиртостійку паличку, а потім визначають чутливість до лікувальних препаратів. Отже діагноз ставиться через 20-50 днів, після чого починається цілеспрямовано лікування хворого. Відоме живильне середовище для виділення збудника туберкульозу, яке містить поживні білкову та поліцукридну складові, хімічні реагенти, розчинник [2]. Але воно не містить достатнього набору інгредієнтів для прискорення виділення збудника Найбільш близьким до заявленого живильного середовища є живильне середовище для виділення збудника туберкульозу, яке містить ферментативний пептон, агар-агар, воду [3]. Але воно також не містить достатнього набору інгредієнтів для прискорення виділення збудника. Найбільш близький до способу одержання живильного середовища є спосіб [4], який включає приготування суміші з живильної основи з та розчинника. Однак початок росту колоній збудника туберкульозу на цьому середовищі виявляється тільки через 20-60 діб, а інколи - через 3 місяці. Відомий стимулятор росту, який містить хімічні реактиви (сполуки), до складу яких входять натрій, кисень, водень, вуглець [5]. Такий стимулятор також дозволяє скоротити час росту мікобактерій туберкульозу, але теж не в достатній мірі, крім того, витрати на його здійснення можуть бути зменшені. Злакових біологічних стимуляторів росту з рівня те хніки невідомо. Завданням заявленого винаходу є створення способу виділення збудника туберкульозу, в якому за рахунок особливих операцій, застосування нового реагенту для обробки посівного матеріалу і особливого живильного середовища та способу його одержання було б можливим скоротити тривалість інкубування матеріалу, час діагностики туберкульозу та бактеріологічні дослідження. Завданням заявленого винаходу є також створення живильного середовища для виділення збудника туберкульозу та способу його одержання, в якому за рахунок нового складу компонентів, їх кількісного співвідношення, нових операцій було б можливе скоротити тривалість інкубування матеріалу та час діагностики туберкульозу бактеріологічним способом. Завданням заявленого винаходу є також створення стимулятора росту зб удника туберкульозу, який за рахунок нового складу дозволив би прискорити ріст мікобактерій туберкульозу, що сприяло б скороченню тривалості інкубування матеріалу. Поставлена задача вирішується наступним чином. Відповідно до заявляємого винаходу у способі виділення збудника туберкульозу, що включає проведення мікроскопії мазка крові, яку використовують як патологічний матеріал для виявлення стадій росту мікобактерій, приготування живильного середовища, підготовку патологічного матеріалу, висів патологічного матеріалу на живильне середовище з наступним термостатуванням, згідно винаходу перед висівом на живильне середовище кров змішують із злаковим біологічним стимулятором росту збудника туберкульозу у співвідношенні 1:1, термостатують протягом 48 годин при температурі 36°¸38° С з отриманням посівної суспензії, яку вносять на живильне середовище. В мазку крові на початковій стадії захворювання виявляють одну із стадій розвитку мікобактерій і в разі виявлення певних стадій розвитку мікобактерій судять про інфікованість або захворювання туберкульозом і далі проводять виділення чистої культури згідно способу, що заявляється. Відповідно до розробленої автором наукової роботи "Особливості біологічного розвитку збудника туберкульозу" [6] мікобактерії туберкульозу при певних умовах проходять ряд послідовних стадій розвитку. В організм хворого попадають фільтровані форми збудника (див. на Фіг. схему розвитку M. tuberculosis). При електронному дослідженні цих форм були виявлені круглі утворення розміром 0,12-0,15мкм, які при сприятливих умовах збільшуються. Вивчення внутрішньої структури цих клітин під електронним мікроскопом дозволило чітко зафіксувати всередині клітини амебоподібні утворення. Материнські клітини, що містили їх, одержали назву артроспори. У період дозрівання артроспори з боку звуженого полюса зсередини виходили позбавлені оболонок амебоподібні клітини, кількість яких збільшувалася шля хом ділення або брунькування. Клітини, які вийшли з артроспори, одержали назву молекути. Це структури мікобактерій туберкульозу (МБТ), що ще не синтезували клітинну стінку. При несприятливих умовах молекути можуть утворювати гігантські клітини і протопласти. Під дією сприятливих факторів навколо молекута утворюється восково-ліпідна оболонка. Молекут поділяється навпіл і в цей період при слабкій восково-ліпідній капсулі в полі зору мікроскопа стають видимі конфігурації, що нагадують диплококи. Під загальною восково-ліпідною оболонкою може утворюватися 2-5 і більше клітин, при цьому вся структура набуває вид палички. У пофарбованому мазку за методом Грам-Муха видна зерниста паличка (зерна Муха), а за Цілем-Нельсоном - паличка рубінового кольору. При наступному стані розвитку паличкоподібні форми при сприятливих умовах переходять у кулеподібні. Цим закінчується стадія розвитку, що умовно названа артроспорою. Надалі кулеподібні форми можуть трансформуватися шляхом дроблення, розподілу, брунькування чи розмножуватися статевим шляхом. Суть процесу дроблення полягає в тому, що в одній кулеподібній клітині, яка збільшується у розмірах, може утворюватися 3 і більше перетинок, що поділяють клітину на декілька нерівномірних частин, з яких потім формуються самостійні кулеподібні й овоїдні клітини. Таке дроблення (розмноження) при сприятливих умовах може повторюватися протягом 24-72 годин. Якщо клітину в цей період розвитку помістити в нове живильне середовище ВКГ ("ВЕКАГЕ"), то через короткий період часу (2-5 доби) кулеподібні форми перейдуть у паличкоподібні, характерні для МБТ. При несприятливих умовах усередині кулеподібної клітини відбувається деструкція ядерної речовини й утворюються овоїдні клітини (проартспори). Суть процесу розподілу полягає в тому, що кулеподібна форма поділяється навпіл зсередини, без зміни зовнішньої структури клітини. У середині клітини утворюються дві рівні частки, які в наступному переходять у самостійні дочірні клітини, що нагадують зовні маленький пиріжок. У кожній дочірній клітині з'являються 1-3 відростки (променя) із зростаючою верхівкою у вигляді трубочки. В клітині відбувається збільшення кількості ядерної речовини, яка рівномірно розподіляється по довжині променя. При дозріванні материнська "клітина-пиріжок" відпадає, а ядерна речовина у середині променя поділяється на дрібні гранули. При забарвленні за Цілем-Нельсоном виявляються характерні МБТ. Несприятливі умови приводять до фрагментації ядерної речовини спільно зі стінкою променя. При цьому утворюються округлі клітини, що зменшуючись у розмірі, набувають здатності проходити через бактеріальний фільтр - так звані "фільтруючі" форми збудника туберкульозу. Статевий процес розмноження кулеподібних МБТ починається з взаємодії двох полярних ("+" і "-") клітин. При цьому клітини збільшуються в розмірі, нагадуючи дріжджоподібну клітину, у якої на десяту добу з'являються вирости у вигляді трубочок з подовженою верхівкою-променем. У клітинах зі зростаючими трубочками відбувається збільшення кількості ядерної речовини. Восково-ліпідна капсула материнської клітини поступово нашаровується на зростаючий промінь, а ядерна речовина по трубочці надходить до зростаючої верхівки. В процесі розвитку відбувається сегментація трубочки з ядерною речовиною на всьому протязі. При сприятливих умовах ширина трубочки за розмірами у 10-15 разів перевищує товщину кожного сегменту. Сегменти збільшуються в поперечному напрямку, утворюючи дугоподібну серповидну структур у. Ядерна речовина розподіляється по дугоподібному утворенню. Надалі оболонка серповидних утворень зменшується, ядерна речовина поділяється на маленькі часточки. У цей період розвитку мікобактерій у мазку, забарвленому за Цілем-Нельсоном, спостерігаються рубінові палички, а при забарвленні мазків за Грам-Мухом - зернисті палички. При посіві таких паличок на живильне середовище Левенштейна-Йенсена виростають типові колонії МБТ. Вн утрішньочеревне зараження морських свинок культурами приводить через 1,0-1,5 місяці до розвитку характерної патологічної форми туберкульозу з наступним виділенням із внутрішніх органів і лімфовузлів культури МБТ. Суть процесу брунькування полягає в тому, що на бічній поверхні зростаючої трубочки з'являються паростки у вигляді бруньок чи паличок, що нагадують зубці гребінця. Ці паростки збільшуються в довжину, утворюючи дугоподібні, серповидні форми, що при подальшому розвитку у сприятливих умовах трансформуються в кислотостійкі палички, що виявляються при забарвленні за методом Грам-Муха. При несприятливих факторах серповидні форми фрагментуються, утворюючи артспори, форми МБТ, що фільтруються. Весь цикл розвитку мікобактерій просліджується в рідкому живильному середовищі ВКГ. Відповідно до заявляємого винаходу живильне середовище для виділення збудника туберкульозу, що містить ферментативний пептон, агар-агар, воду, згідно винаходу додатково містить рослинно-білковий комплемент при такому співвідношенні, мас. %: ферментативний пептон 2-4 агар-агар 3-6 рослинно-білковий комплемент 4-8 вода решта Відповідно до заявляємого винаходу у способі одержання живильного середовища, який включає приготування живильної основи, що містить ферментативний пептон, агар-агар, рослинно-білковий комплемент, воду, згідно винаходу до живильної основи для культивування мікобактерій збудника туберкульозу додають злаковий біологічний стимулятор росту при масовому співвідношенні стимулятора до живильної основи 1,5:20¸30, при цьому живильну основу готують шляхом перемішування компонентів, кип'ятіння до повного розплавлення агар-агару, стерилізації та охолодження, а злаковий біологічний стимулятор готують окремо і потім додають до живильної основи. Стерилізацію живильної основи проводять при температурі 120±2°С протягом 15 хвилин в автоклаві. Живильне середовище готують безпосередньо перед висівом патологічного матеріалу. Відповідно до заявляємого винаходу злаковий біологічний стимулятор збудника туберкульозу містить розчин біологічно-рослинних речовин та як консерватор фенол при наступному співвідношенні, мас. %: розчин біологічно-активних речовин 1,0-1,5 фенол 0,3 - 0,5 вода дистильована решта Екстракцію біологічно активних речовин для одержання стимулятора проводять з використанням бідистильованої води. Приготовлений стимулятор росту зб удника туберкульозу зливають в стерильні флакончики в асептичних умовах, які служать для обробки патологічного матеріалу з подальшою інкубацією і висівом на живильне середовище. Сукупність всіх ознак заявлених винаходів, які об'єднані єдиним творчим задумом, дозволяє одержати зазначений технічний результат, а саме: скоротити тривалість інкубування матеріалу, час діагностики туберкульозу, підвищити чутливість методу, скоротити бактеріологічні дослідження. За рахунок нових ознак у способі виділення збудника туберкульозу: попередньої обробки патологічного матеріалу (крові) новим (злаковим біологічним) стимулятором росту збудника туберкульозу, нового складу живильного середовища для виділення збудника туберкульозу та його приготування створюються умови до досягнення зазначеного технічного результату. Попередня обробка патологічного матеріалу білковим злаковим стимулятором росту збудника туберкульозу прискорює ріст збудника, а їх співвідношення 1:1 обрано як найкраще за результатами практичних досліджень. Аналогічний результат спостерігається від додання стимулятора до складу живильної основи у співвідношенні 1,5:20¸30. Введення до складу стимулятора фенолу як консерватора надає йому антисептичних властивостей, але при цьому він не впливає негативно на збудника туберкульозу. Живильне середовище призначене для ефективного культивування мікобактерій туберкульозу, їх прискореного виявлення в інфікованому матеріалі. Ефективність запропонованого середовища полягає в його збагаченні білково-рослинним комплементом, що також прискорює ріст збудника туберкульозу, скорочує час діагностики. Спосіб виділення збудника туберкульозу реалізують наступним чином. Для виділення збудника туберкульозу готують живильне середовище, здійснюють підготовку патологічного матеріалу (крові) для його подальшого висіву на живильне середовище, при цьому до крові додають в стерильних умовах рівну кількість злакового біологічного стимулятора росту збудника туберкульозу і термостатують при температурі 36¸38°С протягом 48 годин, а потім висівають на живильне середовище. Злаковий біологічний активатор росту збудника туберкульозу використовують приготований заздалегідь, який завдяки введенню до нього фенолу як консерванту має можливість його збереження протягом одного року при кімнатній температурі. Готують його методом настоювання злакових, наприклад пророщених пшеничних злаків. Поживне середовище готують безпосередньо перед висівом патологічного матеріалу. За контрольне беруть живильне середовище за прототипом. Контролем служили тесткультури мікроорганізмів: Mycobacterium tuberculosis Η37RV- збудник туберкульозу людей, Mycobacterium tuberculosis клінічний штам, резистентний до всіх протитуберкульозних препаратів, Mycobacterium tuberculosis - клінічний штам, чутливий до всі х протитуберкульозних препаратів, Mycobacterium bobis - збудник туберкульозу великої рогатої худоби. Підготовлений контрольний посівний матеріал перед висівом обробляють злаковим біологічним стимулятором росту збудника туберкульозу, обробку посівного матеріалу здійснюють протягом 48 годин при температурі 37° С Потім патологічний матеріал (посівний матеріал) - кров, так само як і тесткультури мікроорганізмів, перед висівом обробляють стимулятором росту збудника туберкульозу. До підготовленого згідно із загальноприйнятим методом патологічного матеріалу додають злаковий біологічний стимулятор росту мікобактерій у масовому співвідношенні 1:1, після чого термостатують при температурі 48 годин при температурі 37°С і висівають отриману посівну суспензію в чашки Петрі на живильне середовище у дозі 1,5 мл. Засіяні чашки Петрі не перевертають і розташовують в термостаті кришками догори термостатують при температурі 37°С протягом 1-5 діб. Поява росту колоній на 1-5 добу вказує на позитивний результат. Відсутність росту мікобактерій після 5 діб вважається негативним результатом, що підтверджує відсутність захворювання. Практичне здійснення заявлених вирішень ілюструється наступними прикладами. При цьому приклади наведені за вмістом, який характеризує єдність задуму заявлених винаходів. Приклад 1. Досліди проводили при мінімальних концентраціях живильного середовища, мас.%: ферментативний пептон 2 агар-агар 3 рослинно-білковий комплемент 4 вода решта рН середовища 7,2±0,1 Злаковий біологічний стимулятор росту збудника туберкульозу також був обраний із мінімальною концентрацією компонентів, мас. %: розчин біологічно-активних речовин 1,0 фенол 0,3 вода дистильована решта Живильне середовище приготовляли розміщуючи компоненти живильної основи (попередньо перемелені у лабораторному млину) у очи щеній воді, кип'ятили 3-5 хвилин до повного розплавлення агару, фільтрували через ватно-марлевий тампон, розливали у відповідний посуд і стерилізували при температурі 120±2°С протягом 15 хвилин в автоклаві і після охолодження його до 40-50°С розливали в асептичних умовах на стерильні чашки Петрі в кількості 20-25мл. Після застигання середовища проводили висів суспензії. Суспензію для висіву готували таким чином. Беруть 5мл крові, наприклад з ліктьової вени, додають в стерильних умовах рівну кількість стерильного злакового біологічного стимулятора і витримують в термостаті при температурі 37°С протягом 48 годин, а потім висівають на поживне середовище в дозі 1,5мл. Засіяні чашки не перевертали і ставили в термостат при температурі 37°С протягом 5 діб. Облік результатів проводили після інкубування в термостаті, а в подальшому щоденно до закінчення строку. В результаті проведених досліджень встановлено, що ріст колоній через 48 години спостерігався на чашках з тесткультурами Mycobacterium tuberculosis H37RV- збудника туберкульозу людей та Mycobacterium bobis - збудника туберкульозу великої рогатої худоби і дослідженим патологічним матеріалом. Слід визначити, що на третю добу з'явився на вищезазначених чашках газонний ріст, характерний для збудника туберкульозу. На чашках Петрі, де висівали Mycobacterium tuberculosis - клінічний штам, резистентний до всіх протитуберкульозних препаратів, спостерігався також через 48 годин пригнічений ріст колоній, після 72 годин спостерігався газонний ріст. Тоді як на чашках Петрі, де висівали Mycobacterium tuberculosis - клінічний штам, чутливий до всіх протитуберкульозних препаратів, спостерігався газонний ріст колоній як через 48 годин, так й після 5 діб. Результати досліджень із патологічним матеріалом були аналогічними обраним тесткультурам мікроорганізмів, що підтверджує якість обраних компонентів. Результати досліджень із патологічним матеріалом були аналогічними обраним тесткультурам мікроорганізмів. Приклад 2. Методика досліджень проводилась за схемою, як в прикладі 1, але кількість реагентів була обрана середньою в межах зазначених інтервалів. Так для живильного середовища ця кількість складала, мас. %: ферментативний пептон 3 агар-агар 4,5 рослинно-білковий комплемент 6 вода решта рН середовища 7,2±0,1 Злаковий біологічний стимулятор росту збудника туберкульозу також був обраний із середньою концентрацією компонентів, мас. %: розчин біологічно-активних речовин 1,25 фенол 0,4 вода дистильована решта Результати досліджень у порівнянні з прикладом 1 суттєвої різниці не мали. Приклад 3. Методика досліджень проводилась за схемою, як в прикладі 1, але кількість реагентів була обрана максимальною в межах зазначених інтервалів. Так для живильного середовища ця кількість складала, мас. %: ферментативний пептон 4 агар-агар 6 рослинно-білковий комплемент 8 вода решта рН середовища 7,2±0,1 Злаковий біологічний стимулятор росту збудника туберкульозу також був обраний із середньою концентрацією компонентів, мас. %: розчин біологічно-активних речовин 1,5 фенол 0,5 вода дистильована решта В результаті досліджень встановлено, що ріст колоній через 48 години був більш інтенсивний, ніж у прикладі 1 на чашках із тесткультурами Mycobacterium tuberculosis Н37RV- збудника туберкульозу людей та Mycobacterium bobis - збудника туберкульозу великої рогатої худоби і дослідженим патологічним матеріалом. Газонний ріст у цих ча шках з'явився на другу добу на чашках Петрі, де висівали Mycobacterium tuberculosis клінічний штам, резистентний до всіх протитуберкульозних препаратів, спостерігався ріст колоній через 48 години - більш інтенсивний, ніж у прикладі 1. На чашках Петрі, де висівали Mycobacterium tuberculosis клінічний штам, чутливий до всі х протитуберкульозних препаратів, спостерігався газонний ріст колоній як через 48 годин, так й після 5 діб; також як і у прикладі 1 дослідами із патологічним матеріалом підтверджена якість обраних компонентів. Заявлені вирішення пройшли широку та достатню експериментально-практичну перевірку. Вони є результатами багаторічної роботи автора Власенка В. В. Джерела інформації: 1. Патент України №34746, МПК А61К1/00, C12N1/00, публ. 15.03.2001, бюл. №2. 2. Патент України №18613, МПК С12N1/20, C12Q1/04, публ. 25.12.97, бюл. № 6. 3. Патент України №43467, МПК C12N1/02,1/20, публ. 17.12.2001, бюл. №11. 4. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. / Под ред. М.О. Биргера. - 3-е изд. перераб. и доп. - М.: Медицина, 1982. - С. 79-80. 5. Патент України №8069, МПК С12N1/02,1/20, публ. 25.12.97, бюл. №4. 6. Свідоцтво про державну реєстрацію прав автора на твір. Україна, ПА №4426: Власенко В.В.