Спосіб приготування живильного середовища для виділення облігатних анаеробних коків

Спосіб приготування живильного середовища для виділення облігатних анаеробних коків, шляхом кип'ятіння суміші живильного м'ясо-пептонного бульйону, агар-агара, тіогліколята натрію з послідуючим охолодженням, фільтрацією, стерилізацією 15 хвилин при 0,5 атм., доведенням рН до 7,8-8,0, регенерацією 20 хвилин при 100°С, який відрізняє ться тим, що до складу середовища додають 0,4-0,16% декаметоксина, 0,5-0,25% пропіленгліколя та 1,0% глюкози. (19) (21) 99105432 (22) 05.10.1999 (24) 15.06.2001 (33) UA (46) 15.06.2001, Бюл. № 5, 2001 р. (72) Бірюкова Світлана Василівна, Дяченко Валентина Федорівна, Старобінець Зоя Григорівна, Марющенко Анатолій Михайлович, Давидова Світлана Миколаївна, Волянський Андрій Юрійович, Москаленко Віталій Федорович, Тарасов Олександр Олексійович, Кучма Ірина Юріївна, Джурович Ранко, Доброскок Олександр Іванович, Шаповал Валентин Федорович, Альсабан Абдульхакім 39831 живильний м'ясо-пептонний бульйон з вмістом змінного азоту 120-150 мг% 1,0 л сухе живильне середовище для контролю стерильності виробництва Московського НДІВС ім. Мечникова, до складу якого входять (г/л): 33,0 г ферментативний гідролізат казеїна 15,0 г вітамінний препарат ЕДК 5,0 г натрій хлористий 6,4 г глюкоза 5,0 г цістєін гідрохлорид 0,75г тіогліколят натрія 0,5 г агар-агар 0,6 г натрій вуглекислий 0,5 г натрія тіогліколят 1,0 г натрія метабїсулБфіг 0,1 г натрія гідросульфіт 0,1 г натрій фосфорнокислий двозамісний 1,0 г калій хлористий 0,2 г агар-агар 2,0 г вітамін K1 або менадіон 1% розчин 0,2 мл гемін 1% розчин 1,0 мл твін-80 1,0 мл Спосіб виготовлення середовища В 1,0 л живильного бульйону розчиняютъ 33,0 г сухого живильного середовища для контролю стерильності, додають 15,0 г пептону, по 1,0 тіогліколята натрія та фосфорнокислого натрія, 0,1 г метабісульфіту-натрія, 0,2 г хлористого калію та 2,0 г агар-агара. Суміш кип'ятять 30-40 хвилин, фільтрують, доводять рН до 7,8 - 8,0. Цю основу розливають по флаконах, стерилізують 30 хвилин при 1,5 атм. Перед використанням до регенерованого середовища додають 0,2 мл 3% розчину вітаміну K1 або менадіону, 1,0 мл 1% розчину геміну та 1,0 мл твін-80. Недоліком вказаного середовища є використання за основу сухого середовища для контроля стерильності, яке стало дефіцитним (не виробляється в Україні, інколи надходить з Росії), а також дефіцитність та висока ціна додаткових компонентів (вітамін K1, гемін), відсутність селективних компонентів. Винахід передбачає розробку способу отримання напіврідкого живильного середовища для виділення облігатних анаеробних коків шляхом використання за основу ві тчизняних інгредієнтів та сукупності факторів і впливів, що дозволяють скоротити строки виділення збудників, замінити використання дефіцитної сировини та знизити ціну живильного середовища. Поставлена мета досягається шляхом використання за основу м'ясо-пептонного бульйону та додаванням глюкози, тіогліколята натрія і пропіленгліколя для створення оптимального окислювально-відновного потенціалу середовища в процесі культивування, агар-агара для уповільнення процесу проникнення в середовище атмосферного кисню, декаметоксину для затримання росту аеробних та факультативно анаеробних кокових форм і створення оптимальних умов для росту облігатних анаеробних коків. В експерименті було вивчено вплив різних концентрацій декаметоксина та пропіленгліколя на динаміку росту облігатних анаеробних коків. Експеримент проводили таким чином. До м'ясо-пептонного бульйону додавали агарагар, тіогліколят натрію, декаметоксин в концент рації 0,01%; 0,04%; 0,08%; 0,12%; 0,16%; 0,2%; 0,24%; 0,28% та пропіленгліколь в концентрації 0,1%; 0,15%; 0,2%; 0,25%; 0,3;. Суміш кип'ятили 30-40 хвилин, фільтрували, доводили рН до 7,88,0, стерилізували 15 хвилин при 0,5 aтм. Напіврідке середовище розливали у пробірки по 10 мл. Перед посівом середовище регенерували 20 хвилин при 100°С, охолоджували до 40-45°С, додавали 1% глюкози і засівали тест-культурами мікроорганізмів. Концентрація посівного матеріалу дорівнювала 0,2x109 клітин/мл середовища (КУО/мл). Посіви інкубували 24 години при З7°С. Результати експериментів про вплив різних концентрації декаметоксину і пропіленгліколю на ріст і розмноження анаеробних коків наведені в таблицях 1 і 2. З наведених в табл. 1 даних витікає, що додавання до середовища декаметоксину в концентрації 0,04-0,16% затримує ріст факультативни х коків і не впливає на облігатно-анаеробні кокові форми. Вміст декаметоксину більше 0,20% пригнічує ріст та розмноження облігатно-анаеробних коків. Проведені досліди дозволяють визначити оптимальну концентрацію декаметоксину в середовищі. Вона може бути від 0,04% до 0,16%. Згідно з результатами, наведеними в табл. 2, додавання до складу середовища пропіленгліколю в концентрації 0,15 - 0,25% сприяє збільшенню накопичення біомаси облігатних анаеробних коків порівняно з контролем (середовище без пропіленгліколю). Подальше збільшення концентрації пропіленгліколя (0,3%) недоцільне, бо не призводить до більш інтенсивного накопичення біомаси. Спосіб приготування живильного середовища. До 1 л м'ясо-пептонного бульйону (вміст амінного азоту 120-150 мг%) додають 2,0 г агар-агара, 0,1 г тіогліколята натрію, 0,04-0,16% декаметоксина та 0,15-0,25% пропіленгліколя. Суміш кип'ятять 30-40 хвилин, фільтрують, доводять рН до 7,8-8,0, стерилізують 15 хвилин при 0,5 атм. Середовище розливають по пробірках по 10 мл. Перед посівом пробірки з середовищем регенерують 20 хвилин при 100°С, охолоджують до 40-45°С, додають 1% глюкози і засівають досліджуваний матеріал. Посіви вміщують у термостат на 24 години при 37°С. Приклад 1 До 1,0 л м'ясо-пептонного бульйону (вміст амінного азоту 120 мг%) додають 2,0 г агар-агара, 0,1 г тіогліколята натрію, 0,04% декаметоксину, 0,15% пропіленгліколя. Суміш кип'ятять 30 хвилин, фільтрують, доводять рН до 7,8, стерилізують 15 хвилин при 0,5 атм., розливають по пробірках по 10 мл. Перед використанням пробірки з середовищем регенерують 20 хвилин при 100°С на водяній бані, охолоджують до 40°С, додають 1% глюкози та засівають вивчаєму культуру. Посівна доза дорівнює 0,2 х 109 клітин/мл середовища. Посіви вміщують в термостат на 24 години при температурі 37°С. Через 24 години кількість мікробних клітин складає 2,2 х 109 клітин/мл, валова (абсолютна) швидкість складає 0,10. Приклад 2 Схема приготування середовища аналогічна прикладу 1. До середовища додають 0,08% декаметоксину та 0,2% пропіленгліколю. Посівна доза 0,2 х 109 клітин/мл середовища. Через 24 години культивування кількість мікробних клітин складає 2 39831 3,2 х 109 клітин/мл середовища, валова (абсолютна) швидкість - 0,17. Приклад 3 Схема приготування середовища аналогічна прикладу 1. До середовища додають 0,16% декаметоксину та 0,25% пропіленгліколя. Посівна доза - 0,2 х І09 клітин/мл середовища. Через 24 години культивування кількість мікробних клітин складає 2,8 х 109 клітин/мл середовища, валова (абсолютна) швидкість - 0,14. Для порівняльного вивчення середовища, отриманого за розробленим способом, та прототипу, було використано патологічний матеріал від 58 хворих на гнійно-запальні процеси різної локалізації (абсцеси м'яких тканин, флегмони верхніх та нижніх щелеп, гайморити, отіти, остеомієліти). Проби засівали на живильні середовища та вивчали вирощені культури через 24, 48, 72 години культивування. Результати відображені в табл. 3. Згідно з результатами, наведеними у табл. 3, при засіві патологічного матеріалу в живильне середовище, виготовлене за розробленим способом, облігатні анаеробні коки можна виділити через 24 години, а при засіві у середовище-прототип - через 72 години. Таким чином, використання живильного середовища, виготовленого за розробленим способом, дозволяє скоротити строки бактеріологічного дослідження на облігатну анаеробну мікрофлору в 3 рази в порівнянні з середовищем-прототипом. Таблиця 1 Вплив різних концентрації декаметоксину на ріст та розмноження облігатних та факультативних анаеробних коків Концентрація декаметоксину в середовищі (%) 0,01 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,24 0,30 Примітка: Наявність росту кокових форм у середовищі Кількість посіФакультативно-анаеробні коки Облігатно-анаеробні коки вів стафілококи стрептококи пептококи пептострептококи 12 + + # # 12 0 0 # # 15 0 0 # # 15 0 0 # # 15 0 0 # # 15 0 0 +++ +++ 15 0 0 ++ ++ 15 0 0 0 0 0 - немає росту; + - дуже слабкий ріст - 0,8 х 109 КУО/мл; ++ - слабкий pіcт - 1,2 - 1,8 КУО/мл; +++ - помірний ріст - 2,0 - 2,9 КУО/мл; # - інтенсивний ріст - більше 3,0 х 109 КУО/мл. Таблиця 2 Вплив різних концентрацій пропіленгліколю (ПГ) на динаміку росту облігатно анаеробних кокових форм Тест-штами Пептококи шт. 14 Пептококи шт. 23 Пептострептококи шт. 12 Пептострептококи шт. 33 Кількість мікробних клітин (млрд/мл) через 24 години росту на середовищі з різним вмістом пропіленгліколю контроль (без 0,1% 0,15% 0,2% 0,25% 0,3% ПГ) 1,8±0,09 2,4±0,12 3,2±0,24 3,0±0,19 2,6±0,21 1,2±0,11 1,7±0,11 2,6±0,24 3,2±0,26 3,1±0,21 2,5±0,19 1,7±0,11 2,3±0,37 2,7±0,34 2,9±0,19 2,6±0,42 1,7±0,16 2,4±0,16 2,8±0,24 3,0±0,19 2,7±0,17 3 1,1±0,14 39831 Таблиця 3 Порівняльне вивчення живильного середовища, отриманого за розробленим способом та середовища - прототипу Кількість проб 58 Середовища культивування Середовище, отримане за розробленим способом Середовищепрототип Кількість проб, з яких виділені облігатні анаеробні коки через: Усього 24 години 48 годин 72 години абс. % абс. % абс. % абс. % 32 55,2 30 51,8 2 3,4 27 46,5 27 46,5 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 4