Спосіб виділення збудника туберкульозу, живильне середовище і активатор росту мікобактерій для виділення збудника туберкульозу

1 Спосіб виділення збудника туберкульозу, що включає приготування живильного середовища, підготовку патологічного матеріалу, висів патологічного матеріалу на живильне середовище з наступним термостатуванням, який відрізняється тим, що патологічний матеріал попередньо обробляють активатором росту мікобактерій протягом 24 - 48 годин при температурі 36±1° С з отриманням посівної суспензії, яку вносять на живильне середовище 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що масове співвідношення активатору росту мікобактерій та патологічного матеріалу складає 1 2-5 3 Живильне середовище для виділення збудника Винахід стосується медичної та ветеринарної мікробіологи і може бути використаний в науководослідних і виробничих лабораторіях медичного та ветеринарного профілю У медичній та ветеринарній мікробіологи ВІДОМІ способи виділення збудника туберкульозу, живильні середовища та стимулятори росту для виділення збудника туберкульозу Найбільш близьким до заявленого способу виділення збудника туберкульозу на живильному середовищі є спосіб, який передбачає приготування середовища, підготовку патологічного матеріалу, висів патологічного матеріалу на живильне середовище з наступним термостатуванням [1] Завдяки такому сучасному способу через достатньо короткий термін після термостатування визначається ріст всіх культур, але він може бути вдосконалений як за терміном визначення росту культур, так й за зменшенням матеріальних витрат на його здійснення туберкульозу, що містить сухий ферментативний пептон, агар-агар, воду, яке відрізняється тим, що додатково містить амінокислотний стабілізатор при такому співвідношенні, мас % сухий ферментативний пептон 8-12 агар-агар 2-4 амінокислотний стабілізатор 1-4 вода решта 4 Живильне середовище за п 3, яке відрізняється тим, що вміст змінного азоту в готовому живильному середовищі складає не менше 3 % 5 Активатор росту мікобактерій для виділення збудника туберкульозу, що містить ХІМІЧНІ сполуки, до складу яких входять натрій, кисень, водень, який відрізняється тим, що він містить реактив, до складу якого входять мідь, залізо, натрій, сірка, кисень, водень у масовому співвідношенні 10,24 11,69 14,26 6,8 1,77 27,2 та воду при такому співвідношенні Реактив 0,005-0,015г Вода до ЮООмл Відоме живильне середовище для виділення збудника туберкульозу, яке містить поживні білкову та поліцукридну складові, ХІМІЧНІ реагенти, розчинник [2] Але воно не містить достатнього набору інгредієнтів для прискорення виділення збудника Найбільш близьким до заявленого живильного середовища є живильне середовище для виділення збудника туберкульозу, яке містить сухий ферментативний пептон, агар-агар, воду [1] Але воно також не містить достатнього набору інгредієнтів для прискорення виділення збудника Найбільш близьким до заявленого є відомий стимулятор росту, який містить ХІМІЧНІ реактиви (сполуки), до складу яких входять натрій, кисень, водень, вуглець [3] Такий стимулятор також дозволяє скоротити час росту мікобактерій туберкульозу, але теж не в достатній мірі, крім того, витрати на його здійснення можуть бути зменшені Завданням заявленого винаходу є створення О (О (О 44660 способу виділення збудника туберкульозу, в якому час діагностики туберкульозу, підвищити чутлиза рахунок особливих операцій, застосування новість методу, скоротити бактеріологічні дослідженвого реагенту для обробки посівного матеріалу і ня у ЗО - 90 разів особливого живильного середовища було б можЗа рахунок нових ознак у способі виділення ливим скоротити тривалість інкубування матеріалу збудника туберкульозу попередньої обробки акдо 12 - 24 годин, час діагностики туберкульозу та тиватором росту мікобактерій, нового складу жибактеріологічні дослідження у ЗО - 90 разів вильного середовища для виділення збудника туберкульозу створюється синергетичний ефект, Завданням заявленого винаходу є також ствоякий обумовлює скорочення тривалості інкубуванрення живильного середовища для виділення збуня матеріалу з одночасним підвищенням чутливодника туберкульозу, в якому за рахунок нового сті методу, і як результат - значне скорочення трискладу компонентів, їх КІЛЬКІСНОГО співвідношення валості та обсягу бактеріологічних досліджень у ЗО було б можливим скоротити тривалість інкубуван- 90 разів ня матеріалу до 12 - 24 годин, а час діагностики туберкульозу бактеріологічним способом у ЗО - 90 Введення до складу активатора росту мікобакраз терій амінокислотного стабілізатору збагачує активатор кислотами, яких недостатньо в ферментаЗавданням заявленого винаходу є також ствотивному пептоні рення активатора росту, який за рахунок нового складу дозволив би прискорити ріст мікробактерій Живильне середовище призначене для ефектуберкульозу, що сприяло б скороченню тривалотивного культивування мікробактерій туберкульості інкубування матеріалу до 12 - 24 годин зу, їх прискореного виявлення в інфікованому матеріалі (кров, мокротиння, сеча та ІНШІ) Поставлене завдання досягається наступним Ефективність запропонованого живильного серечином довища полягає у його специфічності, прискореВІДПОВІДНО ДО заявленого винаходу у способі ному росту збудників туберкульозу в первинних виділення збудника туберкульозу, що включає посівах матеріалу Введення до складу живильноприготування живильного середовища, підготовку го середовища нових елементів надає йому необпатологічного матеріалу, висів патологічного махідних для цього властивостей Так, введення до теріалу на живильне середовище з наступним складу середовища МІДІ покращує роботу Na - К термостатуванням, згідно винаходу патологічний насосів мембранної клітини збудника туберкульоматеріал попередньо обробляють активатором зу, натрію - забезпечує доставку амінокислот в росту мікобактерій протягом 24 - 48 годин при теклітини збудника туберкульозу, чим прискорює мпературі 36 ± 1°С з отриманням посівної суспенрозмноження клітин, а сірка приймає участь в окизії, яку вносять на живильне середовище сних процесах, чим також прискорює ріст клітин Причому масове співвідношення активатору Одночасно з цим збільшується вихід - "урожайросту мікобактерій та патологічного матеріалу ність" мікробактерій туберкульозу на живильному складає 1 2 - 5 середовищі, що забезпечує більш високу точність ВІДПОВІДНО ДО заявленого винаходу живильне діагностики туберкульозу середовище для виділення збудника туберкульозу, що містить сухий ферментативний пептон, В результаті досліджень встановлено, що на агар-агар, воду, згідно винаходу додатково містить середовищі, що використане як прототип, ріст мікамінокислотний стабілізатор при такому співвідробактерій з'явився через 20 - 60 діб всіх культур, ношенні, мас % які були узяті в дослід На запропонованому середовищі через 24 години після термостатування сухий ферментативний пептон 8 -12 відмічався ріст усіх культур Через 72 години споагар-агар 2-4 стерігався газонний ріст колоній мікобактерій амінокислотний стабілізатор 1- 4 вода решта Якісний та КІЛЬКІСНИЙ ВМІСТ усіх компонентів в заявлених складах, сукупність операцій способу та Причому вміст змінного азоту в готовому жийого режими в заявлених межах є необхідними, вильному середовищі складає не менше 3% оптимальними для проявлення їх позитивних влаВІДПОВІДНО ДО заявленого винаходу активатор стивостей та досягнення технічного результату росту мікобактерій для виділення збудника туберкульозу, що містить ХІМІЧНІ сполуки, до складу яких Запропоновані вирішення дозволяють при вивходять натрій, кисень, водень, який відрізняється сокому рівні чутливості скоротити бактеріологічні тим, що він містить реактив, до складу якого входослідження у ЗО - 90 разів дять мідь, залізо, натрій, сірка, кисень, водень у Спосіб виділення збудника туберкульозу на масовому співвідношенні 10,24 11,69 14,26 6,8 живильному середовищі ВІДПОВІДНО до заявленого 1,77 27,2 та воду при такому співвідношенні вирішення здійснюють у наступній ПОСЛІДОВНОСТІ Реактив 0,005-0,015г Для виділення збудника туберкульозу готують живильне середовище, здійснюють підготовку паВода до ЮООмл тологічного матеріалу для його подальшого висіву Приготовлений активатор росту мікобактерій на живильне середовище, при цьому посівний ма(стерильний) розливають в стерильні флакончики теріал обробляють за загальновідомою методикою в асептичних умовах, які служать для обробки паі, крім того, його обробляють пропонуємим активатологічного матеріалу з подальшою інкубацією і тором росту мікобактерій Живильне середовище посівом на живильне середовище для виділення збудника туберкульозу готують Сукупність усіх ознак заявлених винаходів, які безпосередньо перед висівом патологічного матеоб'єднані єдиним творчим задумом, дозволяє одеріалу ржати технічний результат, а саме скоротити тривалість інкубування матеріалу до 12 - 24 годин, За контрольне беруть живильне середовище 44660 за прототипом Контролем служили тесткультури мікроорганізмів Mycobactenum tuberculosis H37 RV - збудник туберкульозу людей, Mycobactenum tuberculosis - КЛІНІЧНИЙ штам, резистентний до всіх протитуберкульозних препаратів, Mycobactenum tuberculosis - КЛІНІЧНИЙ штам, чутливий до всіх протитуберкульозних препаратів, Mycobactenum bobis - збудник туберкульозу великої рогатої худоби Підготовлений контрольний посівний матеріал перед висівом обробляють активатором росту мікобактерій, обробку посівного матеріалу здійснюють протягом 24 - 28 годин при температурі 36 ± 1°С Потім патологічний матеріал (посівний матеріал - мокротиння, кров, спинномозкова рідина, частини тканин та інше), так само як і тесткультури мікроорганізмів, перед висівом обробляють активатором росту мікобактерій До підготовленого згідно із загальноприйнятим методом патологічного матеріалу додають активатор росту мікобактерій у масовому співвідношенні 1 2, після чого термостатують при температурі 24 - 48 годин при температурі 36°С і висівають отриману посівну суспензію в чашки Петрі на живильне середовище у дозі 1мл Засіяні чашки Петрі не перевертають і розташовують в термостаті кришками догори термостатують при температурі 36 ± 1°С протягом 1 5 діб Поява росту колоній на 1 - 5 добу вказує на позитивний результат Відсутність росту мікобактерій після 5 діб вважається негативним результатом, що підтверджує відсутність захворювання Практичне здійснення заявлених вирішень ілюструється наступними прикладами При цьому приклади наведені за вмістом, який характеризує єдність задуму заявлених винаходів Приклад 1 Досліди проводили при мінімальних концентраціях всіх компонентів живильного середовища, мас % сухий ферментативний пеп„ тон агар-агар 2 амінокислотний стабілізатор 1 вола В 0 Д а р е ш т а ( д о ЮОмл) Активатор росту мікобактерій також був обраний із мінімальною концентрацією компонентів реактив 0,005г вода до ЮООмл Живильне середовище приготовляли розмішуючи компоненти (які попередньо були перемелені в лабораторному млину протягом 1 0 - 5 5 хвилин) в ЮОмл очищеної води і кип'ятили 3 - 5 хвилин до повного розплавлення агару, фільтрували через ватно-марлевий фільтр, розливали у відповідну посуду, стерилізували при температурі 120 ± 1°С протягом 15 хвилин в автоклаві і після застигання до 40 - 50°С живильне середовище розливали в асептичних умовах на стерильні чашки Петрі по 20мл Через 7 - 1 0 хвилин, як правило, проходить застигання середовища, на яке проводять посів Готове живильне середовище має жовте забарвлення з рН 7,2 ± 0,2 Активатор росту готують окремо шляхом розчинення реактиву, до складу якого входять мідь, залізо, натрій, сірка, кисень, водень у масовому співвідношенні 10,24 11,69 14,26 6,8 1,77 27,2 у воді Підготовлений активатор росту мікобактерій також автоклавували при температурі 120 ± 1°С протягом 15 хвилин в автоклаві Підготовленим стерильним активатором росту мікобактерій обробляли тесткультури мікроорганізмів та патологічний матеріал у співвідношенні 1 2 і термостатували при температурі 36 ± 1°С протягом 24 годин, після чого висівали на свіжеприготоване живильне середовище У всіх випадках посівна доза матеріалу відповідала 1мл Засіяні чашки не перевертали і ставили в термостат при температурі 36±1 °С протягом 5 діб Облік результатів проводили після 24 годин інкубування в термостаті, а в подальшому щодення до закінчення строку В результаті проведених досліджень встановлено, що ріст колоній через 24 години спостерігався на чашках з тесткультурами Mycobactenum tuberculosis H37 RV - збуднику туберкульозу людей та Mycobactenum bobis - збуднику туберкульозу великої рогатої худоби і дослідженим патологічним матеріалом Слід визначити, що на третю добу з'явився на вищезазначених чашках газонний ріст, характерний для збудника туберкульозу На чашках Петрі, де висівали Mycobactenum tuberculosis - КЛІНІЧНИЙ штам, резистентний до всіх протитуберкульозних препаратів, спостерігався також через 24 години пригнічений ріст колоній, після 72 годин спостерігався газонний ріст Тоді ЯК на чашках Петрі, де висівали Mycobactenum tuberculosis - КЛІНІЧНИЙ штам, чутливий до всіх протитуберкульозних препаратів, спостерігався газонний ріст колоній як через 24 години, так й після 5 діб Результати досліджень із патологічним матеріалом були аналогічними обраним тесткультурам мікроорганізмів, що підтверджує якість обраних компонентів Результати досліджень із патологічним матеріалом були аналогічними обраним тесткультурам мікроорганізмів Приклад 2 Методика досліджень проводилась по схемі, як в прикладі 1, але КІЛЬКІСТЬ компонентів була середньою в межах зазначених інтервалів Так для живильного середовища ця КІЛЬКІСТЬ складала, мас % сухий ферментативний пеп1 П тон агар-агар З амінокислотний стабілізатор 2,5 вола В 0 Д а р е ш т а ( д о ЮОмл) Активатор росту мікобактерій також був обраний із середньою концентрацією компонентів Реактив 0,010г Вода до ЮООмл Результати досліджень в порівнянні з прикладом 1 суттєвої різниці не мали Приклад З Методика досліджень проводилась по схемі, як в прикладі 1, але КІЛЬКІСТЬ компонентів в живильному середовищі та активаторі росту мікобактерій була максимальною в межах зазначених інтервалів Так для живильного середовища ця КІЛЬКІСТЬ складала, мас % сухий ферментативний пеп12 8 44660 діб, також як і у прикладі 1 дослідами із патологічтон ним матеріалом підтверджена якість обраних комагар-агар 4 понентів амінокислотний стабілізатор 4 Заявлені вирішення пройшли широку та дорешта (до вода статню експериментально-практичну перевірку 100мл) Вони є результатами багаторічної роботи автора Активатор росту мікобактерій також був обраВласенка В В ний із максимальною концентрацією компонентів Реактив 0,015г Запропоноване поживне середовище просте за способом його приготування, зручне при зберіВода до 1000 мл гання і транспортуванні Всі компоненти заявлених В результаті досліджень встановлено, що ріст складових виробляються в Україні, що є досить колоній через 24 години був більш інтенсивний, зручним для виробничих, науково-дослідних лабоніж у прикладі 1 на чашках із тесткультурами раторій ветеринарного та медичного профілю Mycobactenum tuberculosis Нб7 RV - збуднику туберкульозу людей та Mycobactenum bobis - збуднику Джерела інформації туберкульозу великої рогатої худоби і дослідже1 Справочник по микробиологическим и вируним патологічним матеріалом Газонний ріст у цих сологическим методам исследования Под ред чашках з'явився на другу добу на чашках Петрі, де М О Биргера - 3-е изд , переработанное и доповисівали Mycobactenum tuberculosis - КЛІНІЧНИЙ лненное М , Медицина, 1982, с 7 9 - 8 0 (прототип штам, резистентний до всіх протитуберкульозних для способу виділення збудника туберкульозу, препаратів, спостерігався ріст колоній через 24 живильного середовища) години - більш інтенсивний, ніж у прикладі 1 На 2 Патент України № 18613 від 27 07 93, м кл чашках Петрі, де висівали Mycobactenum С120 1/02, публ 25 12 97, бюл №6 tuberculosis - КЛІНІЧНИЙ штам, чутливий до всіх про3 Патент України № 8069 А від 03 08 93 93, титуберкульозних препаратів, спостерігався газом кл C12N 1/02, публ 25 12 97, бюл № 4 (протонний ріст колоній як через 24 години, так й після 5 тип для активатору росту мікобактерій) ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90