Спосіб вітрифікації мезенхімальних стовбурових клітин

Реферат: Спосіб вітрифікації мезенхімальних стромальних клітин включає двоетапну експозицію клітин з розчином, що містить кріопротектори диметилсульфоксид, етиленгліколь та цукрозу, і швидке охолодження в кріоконтейнерах шляхом занурення в рідкий азот. В розчин вводять кріопротектор 1,2-пропандіол в концентрації 20 %, а як кріоконтейнери використовують кріопробірки. UA 69651 U (54) СПОСІБ ВІТРИФІКАЦІЇ МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН UA 69651 U UA 69651 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі клітинної біології, також може бути використана в біотехнології для кріоконсервування клітин і тривимірних тканинно-інженерних конструкцій. Мезенхімальні стовбурові клітини (МСК) мають такі властивості як здатність до самооновлення, спрямованого мультилінійного диференціювання і регуляції імунної відповіді, тому привертають увагу фахівців у галузях клітинної біології, експериментальної та клінічної медицини. Експериментальне і подальше клінічне застосування МСК потребує удосконалення традиційних та розроблення нових методів кріоконсервування, які б дозволили більшою мірою зберегти їх життєздатність і морфофункціональні властивості. Для кріоконсервування МСК, як правило, застосовують повільне заморожування в середовищах, що містять диметилсульфоксид (ДМСО) [1]. Недоліком таких методів є розвиток кристалізації і цілої групи пов'язаних з нею кріоушкоджень. Крім того, для кріоконсервування клітин шляхом повільного заморожування є необхідним складне устаткування, таке як програмний заморожувач, низькотемпературний холодильник. Альтернативою повільному заморожуванню під захистом ДМСО є вітрифікація, яка включає затвердіння розчину в аморфному (склоподібному) стані без кристалізації, що відкриває нові перспективи для низькотемпературного консервування різних біологічних систем від ізольованих клітин до біоінженерних конструкцій, які розробляють із залученням стовбурових клітин, зокрема МСК [2]. Для вітрифікації клітин дороге устаткування не є необхідним. На теперішній час відомі різні способи вітрифікації клітин. Відомий спосіб вітрифікації сперми без використання кріопротекторів шляхом швидкого заморожування у вигляді тонкої плівки в мідній кріопетлі [3]. Відомий спосіб вітрифікації ембріональних стовбурових клітин в відкритих соломинках в розчині, що складається з 20 % ДМСО, 20 % етиленгліколю (ЕГ) та 0,5 М цукрози [4]. Недоліком цих способів є відсутність стерильності за умови використання кріоконтейнерів відкритого типу [5], що не відповідає сучасним стандартам роботи з біологічним матеріалом [6]. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб вітрифікації суспензії МСК фетальної печінки [7]. Відповідно до способу експозицію суспензії клітин з багатокомпонентним розчином кріопротекторів проводять в два етапи при кімнатній температурі. На першому етапі осад клітин протягом 2 хв ресуспендують в 50 мкл розчину, що містить 10 % ДМСО, 10 % ЕГ та 0,1 М цукрози. Далі отриману суспензію протягом 20-25 сек. змішують з 500 мкл розчину, що містить 20 % ДМСО, 20 % ЕГ та 0,5 М цукрози (17 %), після цього переносять у соломинки об'ємом 0,25 мл і занурюють у рідкий азот. Відігрівання проводять на водяній бані при 37 °C. Для видалення кріопротекторів використовують ступеневе розведення 0,75, 0,5, 0,25 та 0,125 М розчинами цукрози. Недоліком способу є те, що він дозволяє проводити вітрифікацію суспензії клітин тільки в соломинці об'ємом 0,25 мл, що не відповідає потребам консервування МСК і біоінженерних конструкцій для експериментальних та клінічних потреб. Використання в способі кріопробірок, в яких зазвичай консервують 0,5-1,8 мл суспензії клітин, унеможливлюється тим, що такий тип кріоконтейнера характеризується низьким поверхнево-об'ємним співвідношенням, тому швидкість охолодження в ньому є значно нижчою, ніж у соломинці, і під час охолодження розчину з сумарною концентрацією кріопротекторів 57 % (7 моль/л), який зазначено у способі, відбувається процес нуклеації льоду [8]. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити такий спосіб вітрифікації МСК, який би дозволив вітрифікувати клітини в об'ємі не менше 0,5 мл. Ця задача вирішується тим, що в способі вітрифікації МСК, який включає двоетапну експозицію клітин з розчином, який містить кріопротектори ДМСО, ЕГ та цукрозу, і швидке охолодження в кріоконтейнерах шляхом занурення в рідкий азот, згідно з корисною моделлю, в розчин додатково вводять кріопротектор 1,2-пропандіол (1,2-ПД) в концентрації 20 %, а як кріоконтейнери використовують кріопробірки. Введення в розчин 1,2-ПД, який характеризується значно більшою склоформуючою здатністю, ніж ДМСО і ЕГ [9], запобігає нуклеації льоду і дає можливість отримання вітрифікації під час охолодження розчину в кріоконтейнерах з низьким поверхнево-об'ємним співвідношенням, таких як кріопробірки. Використання кріопробірок дозволяє вітрифікувати клітини в об'ємі 0,5-1,8 мл і при цьому виключає ризик контамінації біоматеріала під час вітрифікації, зберігання і транспортування в рідкому азоті відповідно до вимог належної виробничої та клінічної практики [6, 10]. Таким чином, спосіб, що заявляється, дає змогу отримати новий технічний результат, а саме здійснити вітрифікацію МСК в об'ємі не менше 0,5 мл в стерильному кріоконтейнері. Спосіб здійснюють таким чином. 1 UA 69651 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Проводять двоетапну експозицію суспензії клітин з багатокомпонентним розчином кріопротекторів при кімнатній температурі в кріопробірках. На першому етапі клітини протягом 1 хв інкубують в розчині, що містить 5 % ДМСО, 10 % ЕГ, 10 % 1,2-ПД та 0,25 М цукрози. Після цього отриману суспензію змішують з концентрованим розчином кріопротекторів так, щоб кінцеві концентрації складали 10 % ДМСО, 20 % ЕГ, 20 % 1,2-ПД та 0,5 М цукрози, і через 15-20 сек. занурюють у рідкий азот. Відігрівання проводять на водяній бані при 40 °C. Для видалення кріопротекторів використовують розведення 0,5 М розчином цукрози і культуральним середовищем з подальшим центрифугуванням. Осад клітин розводять культуральним середовищем. Приклад 1 Суспензію МСК людини ранніх стадій органогенезу з 5-12 пасажу об'ємом 50 мкл змішували з 50 мкл розчину кріопротекторів в кріопробірці, через 1 хв додавали 400 мкл розчину кріопротекторів. Отриману суспензію клітин в розчині з концентраціями 10 % ДМСО, 20 % ЕГ, 20 % 1,2-ПД та 0,5 М цукрози занурювали в рідкий азот. Зразки зберігали у рідкому азоті протягом 1 місяця. Відігрівання проводили на водяній бані за температури 40 °C. Для видалення кріопротекторів деконсервовані зразки переносили у 0,5 М розчин цукрози (розведення 1:10), після чого повільно додавали культуральне середовище (розведення 1:2). Отриману суспензію центрифугували при 450 g протягом 10 хв. Збереженість МСК людини ранніх стадій органогенезу, оцінена шляхом прижиттєвого забарвлення трипановим синім, в контрольній групі складала 90,3±2,9 %. Після вітрифікації цей показник дорівнював 86,2±2,2 %, що не відрізняється від результатів прототипу (табл.). Крім того, після вітрифікації клітини зберігали здатність прикріплюватись до культуральної поверхні. Так, ефективність адгезії, оцінена через 24 години після поміщення клітин до культуральної посудини, складала 94,2±2,8 % в контрольній групі і 68,3±1,7 % після вітрифікації. При подальшому культивуванні клітин після вітрифікації спостерігали, що вони розпластувались і мали фібробластоподібну морфологію. Клітини проліферували і формували моношар на 3-5 добу культивування. Після пофарбування фіксованих зразків азур-еозином не спостерігали змін тинкторіальних властивостей ядра та цитоплазми в культурі клітин після вітрифікації порівняно з клітинами контрольної групи, що не відрізняється від результатів прототипу. Для визначення диференціювального потенціалу суспензію клітин до та після вітрифікації вносили в лунки 24-лункового планшета та індукували остеогенне диференціювання культивуванням в середовищі, що містило 10 % сироватки ембріонів великої рогатої худоби, 100 нМ дексаметазону, 10 мМ β-гліцерофосфату, 0,2 мМ L- аскорбінової кислоти-2-фосфату (всі виробництва Sigma, США). Через 3 тижні в культурі клітин після вітрифікації і в культурі клітин контрольної групи за допомогою набору "Fast Blue RR Salt, Naphtol AS-MX Phosphate Alkaline Solution kit № 85" (Sigma, США) виявлялася експресія раннього маркера остеогенезу - лужної фосфатази. Сріблення культур за Ван Косом виявило відкладення солей кальцію, що свідчить про характерне для остеобластів накопичення мінералізованого матрикса. При культивуванні клітин контрольної групи і клітин після вітрифікації в адипогенному середовищі, що складалось з середовища культивування, доповненого 10 % адипогенних стимулюючих добавок (Adipogenic Stimulatory Supplements № 05403 (StemCell Inc., Канада), на 3 тиждень спостерігали появу адипоцитів, які мали вигляд великих округлих клітин з вакуолями нейтральних ліпідів, що профарбовувалися масляним червоним Oil Red О (Sigma, США). Приклад 2 Проводили експозицію суспензії МСК об'ємом 100 мкл з розчином кріопротекторів в два етапи при кімнатній температурі в кріопробірках. Отримані суспензії в розчині з концентрацією кріопротекторів 10 % ДМСО, 20 % ЕГ, 20 % 1,2-ПД та 0,5М цукрози об'ємом 1 мл занурювали в рідкий азот. Відігрівання зразків і видалення кріопротекторів проводили, як зазначено вище. Збереженість МСК за забарвленням трипановим синім після вітрифікації в об'ємі 1 мл складала 82,9±2,4 %, що значимо не відрізнялось від цього показника після вітрифікації в об'ємі 0,5 мл, який дорівнював 86,2±2,2 %. Після вітрифікації в об'ємі 1 мл клітини прикріплювались до культуральної поверхні, проліферували і формували моношар. Здатність клітин до спрямованого диференціювання після вітрифікації в об'ємі 1 мл була визначена за умов культивування в остеогенному та адипогенному середовищах. Наведені дані свідчать про те, що після вітрифікації МСК в об'ємі 0,5-1 мл за допомогою способу, що заявляється, клітини зберігають життєздатність, здатність до проліферації і спрямованого диференціювання в остеогенному та адипогенному напрямках. 2 UA 69651 U Таблиця Вплив вітрифікації на життєздатність мезенхімальних стромальних клітин (n=6, р