Спосіб одержання мезенхімальних стовбурових клітин

Спосіб одержання мезенхімальних стовбурових клітин, що включає забір тканини, що є джере 3 52266 В основу корисної моделі поставлено задачу спростити відомий спосіб отримання МСК шляхом використання альтернативного джерела. Ця задача вирішується тим, що в способі отримання МСК, що включає забір тканини, що є джерелом МСК, приготування суспензії клітин, культивування в живильному середовищі і виділення МСК, згідно з корисною моделлю, як джерело МСК використовують головний мозок плоду людини. Головний мозок легко візуально виявляється після розтину черепа, тому не виникає проблем з його одержанням. Тканина головного мозку не містить еритроцитів, що дозволяє виключити етап лізису еритроцитів. Таким чином, головний мозок плоду людини може використовуватися як альтернативне джерело МСК, при цьому процедура отримання МСК набагато простіше, ніж з інших тканин плода. Приклад здійснення способу Головний мозок плодів людини виділяли, промивали фізіологічним розчином і готували суспензію, шляхом продавлювання тканини в живильне середовище, через отвори з діаметром 70мкм. Суспензію клітин головного мозку ресуспендували в живильному середовищі з сироваткою і поміщали в культуральні флакони при 37°С та 5% СО2. Середовище замінювали 2 рази на тиждень. Після досягнення 80% конфлуєнту клітини знімали за допомогою суміші версен - трипсину, у співвідношенні 1:4 і пересіювали у флакони більшого розміру. Надалі проводили 4-5 пасажів культивування до досягнення уніфікації морфології культивованих клітин. Після 4-5 пасажів проводили імунофенотипічний аналіз і визначали потенціал до диференціювання. Для проведення імунофенотипічного аналізу клітини офарбовували моноклональними антитілами CD29-PE, CD45-PE, CD105-FITC (Serotec), CD34 Class II-FITC, CD 38-RPE (DAKO, Голландія), CD44-FITC, CD73-PE (BD Biosciences) відповідно до інструкції виробника, двічі відмивали центрифугуванням при 200g протягом 10хв у сольовому середовищі Дюльбекко і аналізували на проточному цитометрі FACS Calibur (BD Biosciences, США). Результати проточної цитометрії аналізували з використанням програми WinMDI v 2.8. Так, клітини головного мозку, отримані в результаті культивування, були позитивні за мезенхімальними мар Комп’ютерна верстка А. Рябко 4 керами CD29, CD44, CD90, CD105 і негативні за маркерами гемопоезу CD45, CD34. Для визначення диференціювального потенціалу суспензію клітин розводили середовищем культивування з 10% сироватки ембріонів великої рогатої худоби (EC) і вносили в лунки 24-лункового планшета. Остеогенне диференціювання індукували культивуванням в живильному середовищі, що містило 10% EC, 100нМ дексаметазону, 10мМ -гліцерофосфату, 0,2мМ L-аскорбінової кислоти2-фосфату (всі виробництва Sigma, США). В ході тритижневого індукованого диференціювання вони утворювали клітини кістки (що визначалось офарбовуванням на лужну фосфатазу (набір Fast Blue RR Salt, Naphtol AS-MX Phosphate Alkaline Solution kit №85 (Sigma, США)) та накопичували позаклітинний кальцій, оцінений за методом ван Косса. Середовище для індукції адіпогенного диференціювання складалось з середовища культивування, доповненого 10% Adipogenic Stimulatory Supplements №05403 (StemCell Inc., Канада). Клітини культивували при 37°С/95% вологості в атмосфері з 5% СО2 протягом 3-4 тижнів. В результаті спостерігалося накопичення внутрішньоклітинних нейтральних ліпідів, які позитивно забарвлювались Oil Red О (Sigma, США). Наведені дані свідчать про те, що клітини, виділені з головного мозку плоду людини, проявляють властивості мультипотентних мезенхімальних стовбурових клітин. Джерела інформації: 1. Fredenstein AJ, Chailakhyan RK, Lalykina KS The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells//Cell Tissue Kinet. - 1970. - №3. - Р.393-403. 2. Zuk PA, Zhu M., Ashjian P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells // Моl. Biol. Cell. - 2002. - Vol.13, №12. - P.4279-4295. 3. Shih DT, Lee DC, Chen SC et al. Isolation and characterization of neurogenic mesenchymal stem cells in human scalp tissue // Stem Cells. - 2005. Vol.23, №7. - P.1012-1020. 4. Campagnoli С., Roberts IAG, Kumar S., et al. Identification of mesenchymal stem / progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow//Blood. - 2001. - 98, №8. - P.2396-2402. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601