Спосіб генетичного відбору серед плюсових дерев сосни звичайної генотипу з великою кількістю гетерозиготного потомства

Реферат: Спосіб генетичного відбору серед плюсових дерев сосни звичайної генотипу з великою кількістю гетерозиготного потомства включає добір в сімейних випробувальних культурах, виділення ДНК, ампліфікацію мікросателітних локусів Pttx2146 та Spac 11.8 і наступне електрофоретичне розділення ампліконів і визначення генотипів. Як генетичні маркери має алелі 9; 18 за локусом Spac 11.8 та 8; 11 за локусом Pttx2146. UA 71574 U (54) СПОСІБ ГЕНЕТИЧНОГО ВІДБОРУ СЕРЕД ПЛЮСОВИХ ДЕРЕВ СОСНИ ЗВИЧАЙНОЇ ГЕНОТИПУ З ВЕЛИКОЮ КІЛЬКІСТЮ ГЕТЕРОЗИГОТНОГО ПОТОМСТВА UA 71574 U UA 71574 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до лісівництва, зокрема, до селекційного добору генотипів плюсових дерев сосни звичайної з покращеними генетичними показниками насіннєвого потомства для створення лісо-насіннєвих плантацій. У зв'язку зі зростаючими потребами виробничого використання цінних деревних порід і необхідності їх збереження та штучного відтворення, набуває актуальності ефективна організація селекційного процесу, створення насаджень потенційно життєздатних і продуктивних рослин. Традиційні методи лісової селекції, що базуються на груповому та індивідуальному відборі кращих за продуктивністю рослин на основі фенотипічних (морфологічних) ознак, не запобігають попаданню у цю сукупність рослин, які продукують генетично послаблене (інбредне, гомозиготне) потомство. Виникнення такого насіннєвого потомства пов'язано з переважним самозапиленням окремої рослини. Інбредність потомства рослин, зокрема хвойних, виражається у погіршенні показників росту молодих рослин, та в цілому їх життєздатності, і зумовлена підвищеним рівнем гомозиготності, як наслідок самозапилення. Через це згодом гомозиготне потомство у насадженнях може значно відставати в рості. Добре відомо, що найбільш пристосованими та життєздатними виявляються гетерозиготні рослини, які мають підвищений адаптивний потенціал. Запліднення яйцеклітини рослин, що запилюються своїм пилком або перехресно у природних популяціях і штучних насадженнях, є випадковою подією, що залежить від багатьох факторів, в тому числі і від генетичних особливостей конкретної рослини. Тому при селекційному доборі рослин у деревостанах хвойних генетичні показники насіннєвого потомства можна прогнозувати лише стосовно материнських рослин. Оскільки генетична якість потомства багато в чому залежить від генетичних якостей материнських дерев, постає питання пошуку генетичних маркерів тих рослин, що дають потомство з покращеними генетичними якостями (гетерозиготне). Застосування такого насіння дозволить мінімізувати появу маложиттєздатних сіянців вже на ранніх етапах онтогенезу рослин в практиці лісорозведення. Використання молекулярно-генетичних маркерів у селекції рослин відомо з багатьох робіт генетиківселекціонерів. Для ряду видів хвойних винайдені ізоферментні маркерні локуси [1]. Застосування мікросателітних маркерів пропонується для селекції сосни ладанної [2]. Загальними ознаками рішення, що заявляється, і аналога є: спосіб визначення материнських генотипів плюсових дерев сосни звичайної для наступного селекційного процесу, з використанням певних молекулярно-генетичних маркерів. Як прототип вибрано спосіб добору життєздатних, потенційно високопродуктивних рослин хвойних шляхом визначення їх генетичної різноманітності на прикладі сосни звичайної [3], в якому аналізують 3 ізоферментні локуси неспецифічних естераз хвої сіянців. Ці локуси використовують для визначення якісного вмісту білків, аналізуючи отриману електрофоретичним шляхом ділянку ізоферментного спектра, що кодує синтез естераз, і виділяють рослини, які мають максимальну або близьку до неї генетичну гомогенність даної ділянки. Загальними ознаками рішення, що заявляється, і прототипу є: спосіб селекційного добору окремих рослин сосни звичайної, що характеризуються кращими генетичними показниками насіннєвого потомства, використовуючи при цьому молекулярно-генетичні маркери. Однак, в описаному в прототипі способі аналізували тільки сіянці, з яких до створення штучних насаджень рекомендовано використовувати окремі з них, що мають найбільшу генетичну різноманітність на основі ізоферментних локусів, а інші сіянці вибраковували. Це не зовсім раціонально, так як призводить до втрати частки сіянців, на вирощування яких потрачено час і матеріальні ресурси. Значно ефективніше і надійніше для створення лісо-насіннєвих плантацій хвойних проводити пошук таких дерев та генетичних маркерів (наприклад мікросателітних локусів), за якими можливо відбирати рослини, що продукують насіння з покращеними генетичними якостями (гетерозиготне). При доборі таких дерев їхнє насіння і відповідно сіянці мають бути у повному обсязі використані для лісорозведення. В основу корисної моделі поставлено задачу розробки способу добору за мікросателітними локусами ДНК серед плюсових рослин сосни звичайної тих дерев, що продукують високогетерозиготне потомство. Поставлена задача вирішується тим, що у способі генетичного добору серед плюсових дерев сосни звичайної тих, що продукують високо-гетерозиготне потомство, відповідно до корисної моделі, у якості генетичних маркерів використовують мікросателітні локуси Spac 11.8 та Pttx2146. Зазначені ознаки складають суть корисної моделі. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у наступному. 1 UA 71574 U 5 10 15 20 25 30 Пошук серед плюсових дерев сосни звичайної тих, що продукують насіння з підвищеною гетерозиготністю, і їх генетичне маркування здійснювали за двома мікросателітними локусами Spac 11.8 та Pttx2146. Генотипи 25 плюсових дерев визначали таким шляхом: виділену з вегетативних тканин (хвоя) рослин ДНК використовували для полімеразної ланцюгової реакції і отримані амплікони розділяли в поліакриламідному гелі. Електрофорез ампліконів за одним локусом проводили одночасно на сусідніх доріжках гелю. Отримані спектри двох мікросателітних локусів використовували у визначенні генотипів плюсових дерев. Такі ж самі дослідження було проведено стосовно дослідних культур кожного дерева (не менше 10 для кожного дерева). На основі отриманих даних розраховували гетерозиготність потомства кожного дерева. Технічна задача корисної моделі - на основі порівняльного аналізу виділити генотипи плюсових дерев, що мають найбільшу гетерозиготність потомства. Технічний результат способу генетичного добору плюсових дерев сосни звичайної з високою гетерозиготністю насіннєвого потомства полягає в тому, що при створенні лісонасіннєвих плантацій плюсових дерев потрібно використовувати насіння дерев, що мають генотип 9; 18 за локусом Spac 11.8 та 8; 11 за локусом Pttx2146, що дозволить значно мінімізувати частку гомозиготних проростків. Нижче наводиться опис способу генетичного добору за мікросателітними локусами ДНК плюсових дерев сосни звичайної з великою кількістю гетерозиготного потомства, і приклад його конкретної реалізації. Приклад 1. На основі аналізу електрофоретичних спектрів встановлено генотипи плюсових дерев та їх насіннєвого потомства в випробувальних культурах за двома мікросателітними локусами і розраховані показники гетерозиготності потомства (табл.). Встановлено, що плюсові дерева з генотипом генотип 9; 18 за локусом Spac 11.8 та 8; 11 за локусом Pttx2146 продукують насіннєве потомство, гетерозиготність якого на 44% більша, ніж в середньому в проаналізованій вибірці плюсових дерев. Таким чином, розроблений спосіб дозволяє використовувати вищенаведений генотип за мікросателітними локусами Spac 11.8 та Pttx2146 в якості генетичного маркеру для добору серед плюсових дерев сосни звичайної таких генотипів, що продукують підвищену частку високо-гетерозиготного насіннєвого потомства. Саме генотипи 9; 18 за локусом Spac 11.8 та 8; 11 за локусом Pttx2146 плюсових дерев слід використовувати при створенні поліпшених лісонасіннєвих плантацій сосни звичайної. Таблиця Генотипи материнських рослин і гетерозиготність їхнього насіннєвого потомства за двома мікросателітними локусами Генотип материнської рослини Pttx2146 Spac 11.8 5;8 9;16 3;8 21;21 5;8 18;18 5;8 16;16 3;8 16;23 5;8 17;17 8;11 17;17 8;11 9;18 8;8 17;22 В середньому Гетерозиготність нащадків за локусом Pttx2146 Spac 11.8 середня 0,571 0,375 0,473 0,667 0,667 0,667 0,659 0,452 0,556 0,778 0,000 0,389 0,625 0,500 0,563 0,714 0,571 0,643 0,818 0,182 0,500 0,833 0,889 0,861 0,875 0,556 0,715 0,727 0,466 0,596 Перевищення середньої гетерозиготності у нащадків, % -20,6 11,8 -6,8 -34,8 -5,7 7,8 -16,1 44,4 20,0 35 Примітка. Цифрами умовно позначено гени. Гомозиготні рослини позначено однаковими цифрами, гетерозиготні - різними. 40 Джерела інформації: 1. Пат. 15153 A UA, МПК А01Н 01/04, A01G 23/00. Спосіб генетичного маркування і відбору дерев з великою кількістю гетерозиготного насіння у природних популяціях сосни крейдяної: 2 UA 71574 U 5 Деклараційний патент на корисну модель. - І. І. Коршиков, О. А. Мудрик. - № 200512328; Заявл. 21.12.05; Опубл. 15.06.06. - Бюл. 6. - 8 с. 2. U. S. Patent 6,733,965. Microsatellite DNA markers and uses thereof. Echt C. S., Nelson C. D. 3. А. с 1281216 СССР МКИ A01Η 1/4, A01G 23/00. Способ отбора сеянцев хвойных растений / Духарев В. Α., Животовский Л. А. - 1987 (прототип). ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 Спосіб генетичного відбору серед плюсових дерев сосни звичайної генотипу з великою кількістю гетерозиготного потомства, що включає добір в сімейних випробувальних культурах, виділення ДНК, ампліфікацію мікросателітних локусів Pttx2146 та Spac 11.8 і наступне електрофоретичне розділення ампліконів і визначення генотипів, який відрізняється тим, що як генетичні маркери має алелі 9; 18 за локусом Spac 11.8 та 8; 11 за локусом Pttx2146. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3