Спосіб виявлення білків сої в м’ясних виробах та напівфабрикатах конкурентним імуноензимним аналізом

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Спосіб виявлення білків сої в м'ясних виробах та напівфабрикатах конкурентним імуноензимним аналізом, який включає ідентифікацію білків за допомогою конкурентного імуноензимного аналізу (ІЕА) з використанням моноспецифічних антитіл до білків сої, який відрізняється тим, що використовуються нітроцелюлозні смужки (стріпи) як твердофазні носії, які здатні адсорбувати білки, з попередньо нанесеними (сорбованими) на них у відомій концентрації антигенами (білками сої), які інкубували у забуферному фізіологічному розчині (ЗФР) із досліджуваними зразками, біотинільованими антисоєвими моноспецифічними антитілами (мАТ), а після відмивання ЗФР з Твіном 20 для детекції біотинільованих мАТ, інкубують з кон'югатом авідин-пероксидази хрону та проявленням у розчині діамінобензидином/Н2О2.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що для виявлення імунних комплексів використовується реагент авідин-пероксидаза хрону та детекція біотинільованих антитіл з кон'югатом авідин-пероксидази хрону.

Текст

Реферат: Спосіб виявлення білків сої в м'ясних виробах та напівфабрикатах конкурентним імуноензимним аналізом включає ідентифікацію білків за допомогою конкурентного імуноензимного аналізу з використанням моноспецифічних антитіл до білків сої. Згідно зі способом, використовуються нітроцелюлозні смужки (стріпи). UA 71573 U (12) UA 71573 U UA 71573 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної медицини, біотехнології, імунології, зокрема, до способів лабораторної діагностики виявлення білків сої, і може бути використаний для контролю якості продуктів харчування (продукти переробки молока. кондитерські вироби, м'ясні вироби та напівфабрикати). Ситуація у світі з м'ясною сировиною призводить до дефіциту тваринного білка в раціоні харчування населення. Тому в технологіях виробництва харчових продуктів використовується заміна білків тваринного походження білками рослин. Додавання рослинних компонентів до м'ясних продуктів сьогодні є звичайною практикою, в основному із технологічних та економічних причин. Рослинні добавки беруть участь у поглинанні води і мають властивості емульгаторів, є термостабільні і збільшують загальний вміст білків. Соєвий білок володіє здатністю зв'язувати воду, що збільшує питому вагу продуктів і мас негативний вплив на термін їх зберігання. Ці властивості білків сої відомі і часто застосовуються у виробництві м'ясних виробів [1,2] з метою їх фальсифікації [3,4]. Для виявлення білків сої в суміші інших білків широко застосовуються різні варіанти імунохімічних методів (імуногістохімічний, імунохроматографічний, імунодифузія в гелі), які базуються на використанні антитіл, моноспецифічних до білків сої. Кожен з цих методів мас певні позитивні сторони і недоліки. Серед імунохімічних методів виявлення білків найбільш відомим є імуноензимний аналіз (ІЕА), який широко використовується у медицині, сільському господарстві і біотехнології для якісного та кількісного визначення антигенів. На сьогодні розроблено значне число різних варіантів проведення IЕА із відповідними тест-системами. Для виявлення рослинних білків, зокрема білків сої, використовують різні варіанти проведення імуноензимного аналізу з функціоналізацією твердої фази антитілами чи антигенами [5,6,7]. Суть визначення білків (рослинних чи тваринних) за допомогою імуноензимного аналізу (ІЕА) полягає у зв'язуванні специфічних антитіл чи антигенів з твердофазним носієм. яким можуть бути полімерні матеріали, які здатні адсорбувати білки, у вигляді панелей, планшетів, пробірок, кювет, стержнів, гранул тощо [7,8,9]. Цей спосіб грунтується на утворенні складного імунного комплексу побудованого за принципом "сендвіча" - два антитіла і антиген між ними (аналог). Цей спосіб дозволяє якісно і кількісно визначати білки сої в харчових продуктах. Недоліком його є те, що проведення реакції на мікропланшетах з 96 лунками із оптично прозорого полістиролу вимагає використання дорогих фірмових реактивів, спеціального обладнання та приладів, тобто дослідження можливо проводити лише в умовах добре обладнаної біохімічної лабораторії. Пропонуємий спосіб виявлення білків сої в м'ясних виробах та напівфабрикатах конкурентним імуноензимним аналізом грунтується на утворенні імунних комплексів попередньо біотинільованих антитіл із білковими антигенами сої які у відомій концентрації є сорбованими на нітроцелюлозній мембрані, а для детекції біотинільованих антитіл використовється кон'югат авідин-пероксидаза хрону. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб виявлення білків сої в м'ясних виробах та напівфабрикатах конкурентним імуноензимним аналізом, який є експресспособом, дозволяє якісно і напівкількісно визначати білки сої за спрощеною процедурою постановки реакції ІЕА. Технічний результат, який полягає в підвищенні чутливості і специфічності (вибірковості) виявлення білків сої у в м'ясних виробах та напівфабрикатах досягають чим, ідо у постановці конкурентного ІЕА використовують мічені біотином антитіла, які є моноспецифічними до білків сої, та виявлення імунних комплексів "антиген-аптитіло" стандартним реактивом авідинпероксидаза хрону за допомогою пероксидазної реакції. Це дозволяє швидко виявляти білки сої у певному діапазоні концентрацій. Імуноензимний аналіз (ІЕА) визначення білків сої (аналог) ґрунтується на конкурентному імуноензимному аналізі із використанням моноспецифічних антитіл до білків сої. з використанням стандартних 96-лункових полістирольних планшет. Для виявлення відповідних імунних комплексів використовуються «вторинні» (антикролячі) мічені перксидазою антитіла (Фіг. 1). Спосіб виявлення білків сої в м'ясних виробах та напівфабрикатах конкурентним імуноензимним аналізом, що заявляється, передбачає отримання антигенів із соевого борошна, імунізацію кролів та отримання антисироваток, очистку моноспецифічних антитіл афінною хроматографією на колонці із кон'югованими на сефарозі білками сої, біотинілювання моноспецифічних антитіл (мАТ), детекцію біотинільованих антитіл з використанням кон'югату авідин-пероксидази хрону (Фіг. 2). 1 UA 71573 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Обидва способи ґрунтуються на конкурентному імуноензимному аналізі використанням моноспецифічних антитіл до білків сої. У способі, який заявляється, стандартні кількості соєвих білків наносяться на нітроцелюлозні смужки (стріпи) на відміну від застосування стандартних 96-лункових полістерольних планшет. Головна перевага нового способу полягає у тому, що для виявлення комплексів «антиген-антитіло» використовується реагент авідин-пероксидаза хрону на відміну від застосування «вторинних» (антикролячих) мічених пероксидазою антитіл в аналозі. Перевагою застосування реагенту авідин-пероксидази хрону порівняно з кон'югованими із пероксидазою хрону антитіл є їхня висока специфічність і можливість більш тривалою зберігання без втрати активності. Висока специфічність зв'язування реагенту авідинпероксидази із біотильованими антитілами (розведення 1:30 000) значно здешевлює процес проведення аналізу. Для отримання стандартних зразків, білки сої екстрагують із борошна (Shanpong sinology, 0 Китай) протягом 18 год за температури 4 С в забуферному фізіологічному розчині ЗФР, після чого осаджують за допомогою сухого сульфату амонію до виникнення помутніння розчину. Розчин білка центрифугують (10 тис. об/хв.) протягом 10 хв і осад ліалізують протягом 18 год проти ЗФР Діалізат повторно центрифугують і визначають концентрацію білка (спектрофометрично при 280 нм). Білок (2 мкл) наносять на нітроцелюлозну мембрану шляхом експоненціального розведення. Мембрани висушують і місця неспецифічного зв'язування блокують 3 % БСА в ЗФР у присутності 0,05 % Твій 20. Функціоналізовані соєвими білками стріпи можуть використовуватись протягом 6-ти місяців. До зразків м'ясних фаршів додають соєве борошно у кількості від 1 до 10 %, далі білки екстрагують забуферним фізіологічним розчином (ЗФР). Для їх визначення використовуються моноспецифічні антитіла щодо білків сої (антисоя АГ), отримані із сироватки крові імунізованих кролів афінною хроматографією на колонці, що містила іммобілізовані до BrCN-сефарози антигени (соєві білки). Для виявлення зв'язування антитіл білками сої, афінно-очищені антисоєві AT попередньо кон'югували із біотином за допомогою реагенту гідразин-біотин (Sigma, США). Для детекції біотинільованих антитіл використовували кон'югати авідин-пероксидази хрону (Sigma, США). При проведенні патентно-інформаційного пошуку заявником знайдено технічне рішення Конкурентний імуноензимний аналіз (ІЕА) визначення білків сої, у якому є спільні суттєві ознаки із заявленим рішенням (обидва способи ґрунтуються на конкурентному імуноензимному аналізі із використанням моноспецифічних антитіл до білків сої). Однак, цих суттєвих ознак недостатньо для одержання очікуваного технічного результату, який полягає у підвищенні чутливості і специфічності (вибірковості) виявлення білків сої в м'ясних виробах та напівфабрикатах. У якості носіїв антигену (білків сої) нами пропонується використовувати нітроцелюлозні смужки (стріпи) замість 96-лункових імунологічних планшетів, що дозволяє визначити білки сої без використання спеціального обладнання та реєструючої апаратури. Застосування реагенту авідин-пероксидази хрону для визначення імунних комплексів замість «вторинних» мічених пероксидазою антитіл робить Спосіб виявлення білків сої в м'ясних виробах та напівфабрикатах конкурентним імуноензимним аналізом більш надійним і дешевшим порівняно із аналогом. Заявлений спосіб виявлення білків сої в м'ясних виробах та напівфабрикатах конкурентним імуноензимним аналізом, що заявляється, передбачає отримання антигенів із соєвого борошна, імунізацію кролів та отримання антисироваток, очистку моноспецифічних антитіл афінною хроматографією на колонці із кон'югованими на сефарозі білками сої. біотинілювання моноспецифічних AT, детекцію біотинільованих антитіл із використанням кон'югату авідинпероксидази хрону. Спосіб, який заявляється, є чутливий, високо специфічний і дає можливість якісно і напівкількісно визначати вміст білків сої у м'ясних виробах та напівфабрикатах. Спосіб, що заявляється, ґрунтується на утворенні імунних комплексів попередньо біотинільованих антитіл із білковими антигенами сої, які у відомій концентрації є сорбованими на нітроцелюлозній мембрані. На Фіг. 1 зображена принципова схема конкурентного ІЕА білків сої в м'ясних виробах та напівфабрикатах (аналог) фірми Termal Biosystem Ltd. (Велика Британія): на Фіг. 2 - принципова схема запропонованого нами Способу виявлення білків сої в м'ясних виробах та напівфабрикатах конкурентним імуноензимним аналізом; на Фіг. 3 - результати виявлення білків сої у м'ясних фаршах способом, що заявляється (модельний дослід). Спосіб виявлення білків сої в м'ясних виробах та напівфабрикатах конкурентним імуноензимним аналізом виконується таким чином. Нітроцелюлозні смужки (стріпи) із попередньо нанесеними на них у відомій концентрації білків сої поміщають в кювета розміром 2 UA 71573 U 5 10 15 20 25 30 35 40 1x12 см і заливають 1 мл ЗВР. У кювети добавляють одночасно по 100 мкл досліджуваних зразків (екстрактів м'ясних фаршів) і 5 мкл біотинільованих антисоєвих АГ інкубують протягом 1 год за кімнатної температури. Стріпи відмивають 3 рази по 5 хв у ЗФР та інкубують протягом 1 год з кон'югатом авідин-пероксидаза хрону (1:10000). Після цього стріпи відмивають 3 рази по 5 хв у ЗФР у присутності 0,05 % детергенту Твій 20 і фарбують у розчині діамінобензидин/H 2O2. Зафарбовані мембрани висушують і сканують на сканері HP ScanJet G4050. Стріпи, які інкубуються із досліджуваними зразками є тестовими, і за їх забарвленням визначають концентрацію соєвих білків у зразках. Контрольні стріпи вказують на валідність (робочий стан) способу і дають можливість на основі порівняння інтенсивності забарвлення тестових і контрольного стріпів зробити висновок про концентрацію соєвих білків. Експериментальні дослідження свідчать, що спосіб виявлення білків сої в м'ясних фаршах та напівфабрикатах конкурентним імуноензимним аналізом, який заявляється, є достатньо чутливим і високо специфічним. Тривалість аналізу складає 2,5 год. і може бути при потребі зменшена. Спосіб простий у виконанні, і на відміну від аналога не потребує спеціального обладнання та апаратурного забезпечення, дає можливість якісно виявити і напівкількісно визначати вміст білків сої у діапазоні концентрацій від 0,1 до 1 % залежно від способу детекції (фарбування діамінобензидином або хемілюмінесценція). Спосіб може бути проведений в лабораторіях із мінімальним обладнанням. Фіг. 3. Співвідношення соя/м'ясний фарш: (-) - контроль (ЗФР), фарш - (м'ясний фарш у відсутності білків сої). 9:1 - (9 частин фаршу + 1 частина соєвого борошна). 7:3 (7 частин фаршу + 3 частина соєвого борошна), 5:5 - (5 частин фаршу + 5 частин соєвого борошна). 3:7 — (3 частини фаршу + 7 частина соєвого борошна). Джерела інформації: 1. Bookwalter 1978 Bookwalter GN 1978: Soy protein utilization in food systems. Adv Exp Med Biol 105: 749-766 2. Lusas and Riaz 1995) Lusas EW, Riaz MN 1995: Soy protein products processing and use.. 1 Nutr 125: 573S-580S 3. Flores Mungula et al. 2000; Flores-Mungula ME, Bermudez-Almada M. C. Vazquez-Moreno LA 2000: Research Note: Detection of adulteration in processed traditional meat products.. 1 Muscle Foods 11: 319- 325 4. Leitner et al. 2006 Leitner A, Castro-Rubio F, Marina ML, Lindner W 2006: Identification ої marker proteins for the adulteration of meat products with soybean proteins by multidimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Proteome Res 6: 2424-2030 5. Hawker R.. The dot immunobinding assay. Meth. Enzymol. 1986; 121: 484-491. 6. Антитела. Методы. Под ред. Д. Кэтти,- М.: Мир, 1991.- т. 2.- 384 с. 7.Егоров А.И., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. И др. Теория и практика иммуноферментного анализа.- М.: Высшая школа, 1991.- 288 с. 8. Herbrink Р, Van Bussel F J, Warnaar S O. The antigen spot test (AST): a highly sensitive assay for the detection of antibodies. J Immunol Methods. 1982;48: 293-298. 9. Soya Protein Assay Kit. A quantitative method for the detection of Soya Protein in cooked &uncooked foods. Tepnel BioSystems Ltd. (www.tepnel.com). ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 50 55 1. Спосіб виявлення білків сої в м'ясних виробах та напівфабрикатах конкурентним імуноензимним аналізом, який включає ідентифікацію білків за допомогою конкурентного імуноензимного аналізу (ІЕА) з використанням моноспецифічних антитіл до білків сої, який відрізняється тим, що використовуються нітроцелюлозні смужки (стріпи) як твердофазні носії, які здатні адсорбувати білки, з попередньо нанесеними (сорбованими) на них у відомій концентрації антигенами (білками сої), які інкубували у забуферному фізіологічному розчині (ЗФР) із досліджуваними зразками, біотинільованими антисоєвими моноспецифічними антитілами (мАТ), а після відмивання ЗФР з Твіном 20 для детекції біотинільованих мАТ, інкубують з кон'югатом авідин-пероксидази хрону та проявленням у розчині діамінобензидином/Н2О2. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що для виявлення імунних комплексів використовується реагент авідин-пероксидаза хрону та детекція біотинільованих антитіл з кон'югатом авідин-пероксидази хрону. 3 UA 71573 U 4 UA 71573 U Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП ―Український інститут промислової власності‖, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Method for detection of soy enzymes in meat products and prepared food with competitive immunoenzyme method

Автори англійською

Kotsiumbas Ihor Yaroslavovych, Kit Yurii Yaroslavovych, Holubii Yevhen Mykhailovych, Stoika Rostyslav Stepanovych, Schebentovska Olha Mykolaivna

Назва патенту російською

Способ выявления белков сои в мясных изделиях и полуфабрикатах конкурентным иммуноэнзимным анализом

Автори російською

Коцюмбас Игорь Ярославович, Кит Юрий Ярославович, Голубий Евгений Михайлович, Стойка Ростислав Степанович, Щебентовская Ольга Николаевна

МПК / Мітки

МПК: A23L 1/31, G01N 33/53

Мітки: конкурентним, напівфабрикатах, імуноензимним, м'ясних, аналізом, виробах, спосіб, виявлення, сої, білків

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/7-71573-sposib-viyavlennya-bilkiv-so-v-myasnikh-virobakh-ta-napivfabrikatakh-konkurentnim-imunoenzimnim-analizom.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб виявлення білків сої в м’ясних виробах та напівфабрикатах конкурентним імуноензимним аналізом</a>

Подібні патенти