Спосіб одержання гіперімунної діагностичної сироватки крові проти вірусу хвороби ауєскі

Реферат: Спосіб одержання гіперімунної діагностичної сироватки крові проти вірусу хвороби Ауєскі, включає підготовку вірусної сировини - накопичення антигену вірусу хвороби Ауєскі, її інактивацію, компонування інактивованого антигену з олійним ад'ювантом; імунізацію тварин, відбір крові та дослідження сироватки в реакції нейтралізації на предмет наявності специфічних гуморальних антитіл. Як тварин використовують кіз, як антиген вперше використаний вірус хвороби Ауєскі - штам "Петріківський - 2006", до інактивованої вірусвмісної сировини додають олійний ад'ювант (Montanide ISA 25) у співвідношенні 3:1, дев'ятиразову внутрішньом'язову імунізацію кіз компонованою сировиною, з проведенням 2-ої імунізації на 21-у добу, а решту наступних через кожних 7 діб, відбір крові проводять з яремної вени у кількості 200 - 300 мл, а одержана сироватка крові при дослідженні наявності специфічних гуморальних антитіл проти вірусу хвороби Ауєскі в реакції нейтралізації з використанням перещеплюваної культури клітин ПТП містить титри антитіл на рівні 10,5±0,12 log2. UA 71659 U (54) СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ГІПЕРІМУННОЇ ДІАГНОСТИЧНОЇ СИРОВАТКИ КРОВІ ПРОТИ ВІРУСУ ХВОРОБИ АУЄСКІ UA 71659 U UA 71659 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої належить корисна модель: ветеринарна вірусологія, зокрема для одержання гіперімунної сироватки крові з високим рівнем специфічних гуморальних антитіл проти вірусу хвороби Ауєскі свиней та її застосуванням у серологічних та вірусологічних тестах. Рівень техніки. Аналог корисної моделі. Способ получения диагностической сыворотки к вирусу болезни Ауески. Патент Российской Федерации № 2036660 Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных Автор(ы): Мищенко В. А.; Корниенко Л. Н.; Костюченко М. Г.; Белоконъ B. C.; Корниенко Л. Е. В даному способі імунізації як донори використовуються морські свинки вагою 400-500 г. Гіперімунізація донорів здійснюється емульсією, що складається з рівним співвідношенням інактивованого концентрованого антигену вірусу хвороби Ауєскі, репродукованого в культурі клітин, і масляного ад'юванта. Перша ін'єкція вказаного препарату проводиться в стегнову групу м'язів, друга на 20-22-й день, третя на 28-30-й день після першої. Відбір крові здійснюється на 39-40-й день після початку імунізації. Підвищення специфічної активності одержаних сироваток досягається за рахунок того, що як донори використовуються морські свинки, для яких не характерні хвороби, що як правило реєструються на свинях, вівцях і кролях і, як наслідок, немає і антитіл до їх збудників. Використання інактивованого антигену дозволяє уникнути потрапляння в організм вірусів контамінантів культур клітин. Введення концентрованого антигену, емульгованого з масляним ад'ювантом, дозволяє значно підвищити імунологічну відповідь донорів. Використання як неспецифічного стимулятора імуногенезу масляного ад'юванта, а також введення великих концентрацій антигену призводить до синтезу антитіл, що належать, в основному, до IgG. Це особливо важливо для імунохімічних реакцій, що використовуються для діагностичних цілей. Отримані діагностичні сироватки придатні для постановки РЗК, РН, РДП, ІФМ, а також для виготовлення діагностичних препаратів для ІФМ і ЕІА. При постановці імунохімічних реакцій використання отриманої сироватки веде до зниження можливих помилкових реакцій. Приклад 1. Для виготовлення антигену використовується вірус хвороби Ауєскі, репродукований в культурі клітин ВНК-21, що позитивно реагує в РСК зі специфічними сироватками в цілісному вигляді або у розведенні до 1:4 і має інфекційну активність 7,5-8,0 ТЦД 50/мл. Після видалення клітинного детриту в суспензію додається 20 % (за об'ємом) 50 %-ний стерильний розчин поліетиленгліколю мол. м. 6000. Після ретельного перемішування суспензії витримується 16-18 год. при 4 °C і потім центрифугуванням відокремлюється осад. Останній піддається ресуспендуванню в 1/100 початкового об'єму в розчині Хенкса. До отриманого препарату концентрованого вірусу додається формалін до кінцевої концентрації 0,2 % та інкубується при 37 °C протягом 48 год. Для нейтралізації формальдегіду в суспензію інактивованого вірусу додається 1 М розчин тіосульфату натрію з розрахунку 10 % до обсягу використаного формальдегіду. Отриманий антиген перевіряється на вірулентність і активність в РСК і ІФМ. Інактивований концентрований антиген з активністю в РСК не менше 1:16 в рівному співвідношенні піддається емульгації з масляним ад'ювантом і отримана емульсія вводиться морським свинкам в стегнову групу м'язів в обсязі по 1,0 мл. Через 20-22 дні цей же препарат вводиться аналогічно, але в іншу кінцівку. Третю ін'єкцію проводять через 28-30 днів після першої. Донори знекровлюються через 39-40 днів після першої імунізації. З отриманої крові відомим способом відокремлюється сироватка. Приклад 2. Підготовка емульсії і імунізація морських свинок проводиться так, як описано в прикладі 1. Відмінність полягає в тому, що вірус репродукується в культурі клітин ПСГК-30, а інактивація проводиться аміноетилетиленіміном в кінцевій концентрації 0,15% при температурі 26-2 8 °C протягом 24 год. Приклад 3. Підготовка матеріалів і імунізація морських свинок проводиться так, як описано в прикладі 1. Відмінність полягає в тому, що вірус репродукується в культурі клітин ППК-66. Приклад 4. Підготовка матеріалів і імунізація морських свинок проводиться так, як описано в прикладі 2. Відмінність полягає в тому, що вірус репродукується в культурі клітин IB-RS-2. Однак цей спосіб має ряд недоліків: додавання до інактивованого антигену 50 % ад'юванту збільшує густину компонованої суміші (антиген+ад'ювант), тим самим спричинюючи сповільнене всмоктування антигену в кров, тому інтервал між імунізаціями повинен бути збільшений. Використання як біологічної моделі організму морських свинок є трудомістким в плані відбору крові з порожнини серця (потребує навиків відбору крові) та мізерної її кількості 2-5 мл. Оскільки 1 UA 71659 U 5 10 15 20 кров у цих видів тварин відбирається голкою з порожнини серця, кількість відборів є обмеженою 3-4, а тварина підчас цих маніпуляцій може загинути. З відібраної крові можна одержати 40 % сироватки (0,8-2 мл ), що є недостатньою кількістю при постановці як позитивного контролю реакції нейтралізації та виготовленні наборів діагностикумів. Даний аналог взято як найближчий прототип. В основу корисної моделі поставлена задача розробити ефективну схему гіперімунізації кіз та одержати специфічну сироватку крові з високим титром специфічних гуморальних антитіл проти вірусу хвороби. Поставлена задача вирішується тим, що як антиген вперше використаний та одержаний нами вірус хвороби Ауєскі - штам "Петріківський - 2006", що задепонований в Державному науково контрольному інституті біотехнологій і штамів мікроорганізмів № Держреєстрації 532, за біологічну модель використано не морських свинок, а кіз віком 1,5 року, яким інактивований антиген з олійним ад'ювантом (Montanide ISA 25) у співвідношенні 3:1 вводять десятиразово замість триразового, відбір крові у кіз здійснюють з яремної вени у кількості 200-300 мл замість 2-5 мл з порожнини серця морської свинки, а рівень специфічних антитіл в сироватці крові при дослідженні у реакції віруснейтралізації з використанням перещеплюваної культури клітин ПТП досягає титру 10,5±0,12 log2. Процес одержання гіперімунної діагностичної сироватки крові проти вірусу хвороби Ауєскі полягає в наступному: до проінактивованої вірусвмісної сировини з попереднім титром 5,5 3 антигенної активності штаму "Петріківський - 2006" 10 lg ТЦД50/см додають олійний ад'ювант Montanide ISA 25 у співвідношенні 1 частина ад'юванта : 3 частини вірусвмісної суспензії. Приготовлений антиген вводять козі у кількості 9 разів протягом 3,5 місяців. Введення антигену 3 здійснюють внутрішньом'язово, поперемінно в ділянку шиї та стегна, об'ємом 2 см . Схема імунізації наведена в таблиці. Таблиця Схема гіперімунізації кози вірусом хвороби Ауєскі Кратність імунізації 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Інтервал між імунізаціями, діб 21 7 7 7 7 7 7 7 Місце введення вірусу внутрішньом'язово внутрішньом'язово внутрішньом'язово внутрішньом'язово внутрішньом'язово внутрішньом' язово внутрішньом'язово внутрішньом'язово внутрішньом 'язово Кількість вірусу 3 2 см 3 2 см 3 2 см 3 2 см 3 2 см 3 2 см 3 2 см 3 2 см 3 2 см 25 30 35 40 При кожній імунізації від тварини відбирають кров, з якої в умовах лабораторії одержують сироватку, котру піддають інактивації при t +56 °C протягом 30 хвилин та досліджують на наявність титру специфічних антитіл у реакції віруснейтралізації. Результати досліджень приведені на рисунку. Згідно з зазначеного рисунку впродовж 9 імунізацій в сироватці крові піддослідної тварини спостерігали зростання титру специфічних антитіл. Так, через 21 добу після 1-го введення антигену титр антитіл становив 4,17±0,07 log2. Після наступних 8-ми реімунізацій з інтервалом у 7 діб титри антитіл зростали в межах 1-го логарифму, а максимальний рівень антитіл складав 10,5±0,12 log2. В результаті проведених досліджень нами було одержано специфічну сироватку крові проти вірусу хвороби Ауєскі штам "Петріківський - 2006". Дана сироватка крові може використовуватися з різною метою в різних серологічних та вірусологічних тестах. Бібліографічні дані: Способ получения диагностической сыворотки к вирусу болезни Ауески. Патент Российской Федерации № 2036660 Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных Автор(ы): Мищенко В. Α.; Корниенко Л. Н.; Костюченко М. Г.; Белоконь B. C.; Корниенко Л. Е. 2 UA 71659 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 Спосіб одержання гіперімунної діагностичної сироватки крові проти вірусу хвороби Ауєскі, який включає підготовку вірусної сировини - накопичення антигену вірусу хвороби Ауєскі, її інактивацію, компонування інактивованого антигену з олійним ад'ювантом; імунізацію тварин, відбір крові та дослідження сироватки в реакції нейтралізації на предмет наявності специфічних гуморальних антитіл, який відрізняється тим, що як тварин використовують кіз, як антиген вперше використаний вірус хвороби Ауєскі - штам "Петріківський - 2006", до інактивованої вірусвмісної сировини додають олійний ад'ювант (Montanide ISA 25) у співвідношенні 3:1, дев'ятиразову внутрішньом'язову імунізацію кіз компонованою сировиною, з проведенням 2-ої імунізації на 21-у добу, а решту наступних через кожних 7 діб, відбір крові проводять з яремної вени у кількості 200 - 300 мл, а одержана сироватка крові при дослідженні наявності специфічних гуморальних антитіл проти вірусу хвороби Ауєскі в реакції нейтралізації з використанням перещеплюваної культури клітин ПТП містить титри антитіл на рівні 10,5±0,12 log2. Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3