Спосіб одержання алергену з вірусу хвороби ауєскі

Спосіб одержання алергену з вірусу хвороби Ауєскі, що включає репродукцію на культурі клітин вірулентного вірусу, відділення клітинного детриту, концентрацію, консервацію і інактивацію вірусу, який відрізняється тим, що вірус розрушують шляхом прогрівання при 100 °С протягом 3040 хвилин, концентрують поліетиленгліколем, з молекулярною масою 6000 кДа (ПЕГ-6000), з кінцевим вмістом його 10%, при температурі 4+6°С протягом 18-24 годин. (19) (21) 97125754 (22) 02.12.1997 (24) 16.10.2000 (33) UA (46) 16.10.2000, Бюл. № 5, 2000 р. (72) Конаржевський Костянтин Євгенович, Цимбал Олександр Михайлович, Сербиненко Тетяна Миколаївна, Самойлюк Вячеслав Володимирович, Бабкін Валерій Федорович (73) ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ КЛІНІЧНОЇ ТА ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ 28999 для інфікованого молодняка і для дорослих свиней через 90 і більше днів після їх перехворювання, а також певна складність виготовлення препарату. Завданням цього винаходу є підвищення активності і специфічності алергену та спрощення методу його виготовлення. Поставлене завдання досягається тим, що алерген готується з вірулентного вірусу хвороби Ауєскі, репродукованого на гомологічній для свиней перещеплюваній лінії СНЕВ (свиняча нирка ембріональна версенізована), який після звільнення його від клітинного детриту центрифугуванням при 2500-3000 об/хв протягом 30 хвилин, концентрується осадженням ПЕГ-6000 шляхом добавлення його у вірусутримуючу рідину до кінцевого вмісту 10% і витримування при температурі 4+6°С протягом 13-24 годин з послідуючим центрифугуванням при 2500-3000 об/хв протягом 30-40 хвилин і розчиненням осаду забуференому фізіологічному розчині (рН 7,2) в об'ємі меншому в 10 разів за початковий об'єм вірусутримуючої рідини, після чого до концентрованого вірусу добавляється рівна кількість хімічно чистого гліцерину, і ця суміш прогрівається при температурі 100°С протягом 3040 хвилин. Порівняльний аналіз з прототипом дозволяє зробити висновок про те, що даний спосіб відрізняється від відомого використанням вірулентного вірусу хвороби Ауєскі, репродукованого на перещеплюваній клітинній лінії СНЕВ, застосуванням для концентрації вірусу ПЕГ-6000 та прогрівання його при температурі 100°С, завдяки чому підвищується специфічна активність алергену і його діагностична ефективність, що відповідає критерію "новизни". Сукупність перечислених ознак забезпечує оптимальні умови для одержання висококонцентрованого вірусу, його максимального розрушення з вивільненням специфічних алергеноактивних речовин, надійної інактивації і високої чутливості алогену. Правомірність вищевказаних ознак обгрунтовано результатами досліджень по встановленню ступені концентрації вірусу, вивченню стерильності і нешкідливості алергену, з також відсутності у нього дермотоксичних, сенсибілізуючих, антигенних властивостей і наявності специфічної активності на свинях різного віку - інтактних, перехворілих, імунізованих вакцинами різних типів. Ступінь концентрація вірусу, що застосовувався для виготовлення алергену, вивчали шляхом визначення його летальної активності для кролів масою 1,8-2 кг, яким вводили вірус початковий і концентрований ПЕГ'ом в десятикратних розведеннях від 10-1 до 10-10 (в дозі 1,0 см 3 кожне розведення 4-м кролям підшкірно). Цим дослідженням підданий вірус хвороби Ауєскі, застосований для виготовлення двох серій алергену (табл. 1). Як видно з табл. 1 титр вірусу, розрахований за методом Ріда і Менча, після концентрації підвищувався у десять разів. Стерильність алергену перевіряли шляхом висівів на поживні середовища для індикації аеробної, анаеробної і грибної мікрофлори; нешкідливість - введенням підшкірно кролям масою 1,8-2 кг препарату в дозі 1 см 3 (спостереження за кролями вели протягом 10 днів); відсутність дермотоксич них, антигенних і сенсибілізуючих властивостей визначали внутрішньошкірним введенням алергену в дозі 0,2 см 3 інтактним підсвинкам 4-5-ти місячного віку (по 2 голови підсвинків на кожну серію алергену) активність - на підсвинках такого ж віку, інфікованих вірусом хвороби Ауєскі, або на свинях моделях цього тесту, імунізованих емульсінвакциною. Алерген вводили в шкіру основи вуха в дозі 0,2 см 3, облік реакції проводили через 24-4872 години. Одержаний алерген випробували в лабораторних дослідах на 120 головах підсвинків 4-5-ти місячного віку - інтактних та заражених вірулентним культуральним вірусом хвороби Ауєскі інтраназально в дозі 104 ТЦД50, а також на свинях такого ж віку, імунізованих вакцинами проти хвороби Ауєскі різних типів. Алерген випробували також на свиноматках і кнурах в неблагополучному на хворобу Ауєскі господарстві у всіх тварин паралельно з алергічною пробою вивчали сироватки крові в реакції нейтралізації вірусу хвороби Ауєскі (РН ВХА) на культурі перещеплюваних клітин лінії СНЕВ проти 1000 ТЦД50/см 3ВХА. Частину тварин, які реагували позитивно і негативно в алергічній пробі і РН, забивали і досліджували на наявність ВХА в півкуля х головного мозку, гангліях трійчастого нерву, мигдаликах, слизовій оболонці носу і в різних паренхіматозних органах (в біопробі на кролях і культурі клітин СНЕВ). Результати досліджень п'яти серій алергену, названого нами аулергіном, показали, що препарат був стерильним, нешкідливим, тобто всі кролі в цих дослідженнях залишились живими і здоровими; у нього була відсутня дермотоксичність, тобто він не викликав патологічних змін в шкірі в місці введення інтактним свиням, а також відсутні сенсибілізуючі і антигенні властивості, про що свідчить відповідно негативна ВНМВХА. В той же час алерген володів високою специфічною активністю - у всі х інтактних свиней реакція була негативною, а у всіх інфікованих ВХА тварин - позитивною. Позитивна шкірна реакція виражалась тістуватою припухлістю рожево-червоного кольору, з некрозом епітелію в центрі, розміром 20-30 мм і більше, вона з'являлась через 8-10 годин і досягала максимуму через 24 години. Позитивна шкірна реакція на введення алергену виявлялась у інфікованих свиней різного віку (4-24 місяці) через 2-4 тижні і протягом не менше 2-х років після зараження, а також у свиней, імунізованих живою вакциною ВГНКІ та емульсінвакциною ІЕКВМ-ВНДІЗТ проти хвороби Ауєскі через 3-4 тижні і протягом не менше 12 місяців після вакцинації (строк дослідження). Результати алергічної проби співпадали з показниками серологічних та вірусологічних досліджень, які свідчили про здатність алергену виявляти свиней-носіїв вірусу хвороби Ауєскі не гірше, ніж серологічний метод (табл. 3). В комісійному досліді алерген випробувався на нешкідливість, відсутність дермотоксичних, антигенних, сенсибілізуючих властивостей і на специфічну активність в лабораторних умовах на 6 свинях річного віку, а також - на технологічність застосування в умовах благополучного на хворобу Ауєскі господарстві - на 48 головах основних свиноматок. За висновками комісії пропонований ІЕКВМ алерген (аулергін) є нешкідливим, специфі 2 28999 ном (80 см 3) інактивували стерилізацією текучим паром при температурі 100°С 30 хвилин. Після закінчення інактивації ємкість з інактивованим остуженим вірусом (алергеном) ретельно збовтали і із неї, з метою перевірка стерильності, зробили висіви в 3 пробірки з МПА, МПБ і МППБ під вазеліновим маслом і агар Сабуро в дозі по 0,3 см 3. Висіви витримали протягом 14 діб в термостаті при температурі 37°С, а висіви на агар Сабуро - при температурі 22+24°С. Всі висіви були стерильні. Крім того, відібрали пробу алергену в кількості 3 см 3, яку для перевірки нешкідливості ввели двом кролям масою 1,8-2 кг підшкірно на боковій поверхні тулубу в дозі 1 см 3. При спостереженні протягом 10 діб кролі залишились живини і здоровими, тобто алерген був нешкідливим. Після цього алерген розфасували стерильною піпеткою в добре промиті стерильні флакони по 10 см 3, герметично закрили гумовими пробками і закатали алюмінієвими ковпачками. Алерген, названий нами аулергіном, являв собою прозору безбарвну рідину. Відсутність дермотоксичних, антигенних і сенсибілізуючих властивостей у виготовленого алергену перевірили в одночасному досліді на 2-х інтактних підсвинках вагою по 50 кг і ввели алерген внутрішньошкірно в основі вуха в дозі 0,2 см. Через 3 тижні після цього у тварин взяли кров, сироватку якої дослідили в РН ВХА. Після цього тваринам повторно ввели алерген внутрішньошкірно в основу вуха в дозі 0,2 см 3. Результати цих досліджень свідчили про відсутність у алергену дермотоксичних, антигенних і сенсибілізуючих властивостей, оскільки змін в шкірі на місці введення алергену через 24-72 години і пізніше не було, ВН-антитіла не виявлялись, шкірна реакція на повторне введення алергену була негативною. Специфічну активність алергену визначали на 4-х підсвинках масою 50 кг, яких за 3 тижні до цього сенсибілізували до вірусу хвороби Ауєскі емульсінвакциною ІЕКВМ-ВНДІЗТ проти хвороби Ауєскі введенням її в м'язи стегна в дозі 2 см 3. Через 24 години в усіх тварин на шкірі в місці введення алергену виявлено рожеву пухлинність до 20 мм в діаметрі, болючість, некроз епідермісу, тобто позитивну реакцію, що свідчило про виражену специфічну активність препарату. Приклад 2. Спосіб одержання алергену здійснювався, як описано вище, однак, для виготовлення препарату застосовувався вірус з титром 10-8,5 ТЦД 50/см 3 до його концентрації і прогрівання його при температурі 100°С протягом 40 хвилин. Одержаний алерген (всього 470 мл) при перевірці, як описано вище, був стерильним, нешкідливим, у нього були відсутні дермотоксичність, антигенність і сенсибілізуючі властивості і він мав високу специфічну активність. чним і технологічним діагностичним препаратом, придатним для прижиттєвого виявлення свинейвірусоносіїв при хворобі Ауєскі шляхом масових досліджень в шкірній пробі. Приклад виконання Приклад 1. Спосіб одержання алергену що пропонується, здійснювався слідуючим чином. Культуру перещеплюваних клітин лінії СНЕВ, що вирощена у вигляді моношару в 3-х матрасах об'ємом на 1500 см 3 кожний на ростовому живильному середовищі (середовище 199, яке утримувало 10% сироватки крові великої рогатої худоби і антибіотики - пеніцилін по 100 сд/см 3 і стрептоміцин по 100 мкг/см 3) після заміни ростового середовища на підтримуюче (середовище 199 з антибіотиками) заражали вірусом хвороби Ауєскі штам "УНИИЭВ 18 в" 16 пасажу на клітинах лінії СНЕВ з можливістю зараження 0,5 ТЦД50) клітин. Заражені клітини в матрасі інкубували в стаціонарному положенні в термостаті при температурі 37°С до повної дегенерації і сповзання клітинного моношару внаслідок цитопатичної дії вірусу, що відбулась за 36 годин після зараження (титр вірусу при послідуючій титрації на кролях - 108 ЛД50 /cм 3). Одержаний вірус центрифугували при 3000 об/хв протягом 30 хвилин. Надосадову рідину зібрали в один флакон ємкістю 500 см 3, а осад (клітинний детрит) знешкодили шляхом автоклавування при 2 атм. (+132°С) протягом 2-х годин. Для концентрації вірусу використали ПЕГ-6000. З цією метою виготовили 50% розчин ПЕГ на стерильній дистильованій воді. Для кращого розчинення розчин підігріли до 40°С, потім фільтрували через ватно-марлевий фільтр і стерилізували в автоклаві при 110°С протягом 30 хвилин. С уміш вірусу з ПВГ-6000 виготовили з розрахунку до 400 см 3 центрифугованого вірусу добавили 100 см 3 стерильного 50% розчину ПЕГ. Цю суміш ретельно збовтали і витримали при 4+6°С протягом 24 годин. Після цього суміш вірусу і ПЕГ центрифугували при 3000 об/хв протягом 30 хвилин. Надосадову рідину злили і знешкодили автоклавуванням при 2 атм, (132°С) протягом 2-х годин. До осаду добавили фізіологічний розчин аСІ з рН 7,2 в кількості 40 см 3, тобто в 10 разів менше, ніж було взято початкового вірусу. Для розчинення осаду його витримували при кімнатній температурі 2 години, потім центрифугували при 3000 об/хв протягом 30 хвилин, осад відкинули і знешкодили, а до недосодової рідини, яку зливали в одну ємкість (40 см 3 з титром вірусу, що визначався при послідуючій титрації 10-9ЛД50 /см 3 кролів), додавала таку ж кількість стерильного хімічно чистого гліцерину (стерилізація його проводилась напередодні при 110°С протягом 40 хвилин). Суміш концентрованого вірусу з гліцери 3 28999 Таблиця 1 Визначення титру початкового і концентрованого вірусу хвороби Ауєскі Вірус, що досліджувався Серія вірусу І П І П Початковий Концентрований 10-7 1 4 4 4 4 2 4 4 4 4 1 4 4 4 4 Розведення вірусу 10-8 10-9 2 1 2 4 3 4 4 4 4 4 Титр вірусу ЛД50/см 3 10-10 2 0 1 2 3 1 4 4 4 4 2 0 0 0 1 10-8 10-8,5 10-9 10-9,5 Примітка: 1. Кількість заражених кролів 2. Кількість кролів, що загинули Таблиця 2 Показники шкірної проби на алерген у свиней різних груп Вік тварин (місяць) 4-12 4-5 12 24 Інфіковані вірусом хвороби Ауєскі Імунізовані вакциною ВГНКІ проти хвороби Ауєскі Імунізовані емульсінвакциною 6 0 6 4-5 Інтактні Кількість тварин в гр упах 120 Ж 6 5 4-5 Групи свиней Реагували в шкірній пробі негативно позитивно 120 0 0 80 0 6 0 5 8 0 8 Таблиця 3 Порівняльні дані алергічних, серологічних і вірусологічних обстежень свиней, інфікованих вірусом хвороби Ауєскі Групи свиней Підсвинки Свиноматки Кнури Вік Шкірний тварин Кількість Реагув. (міс.) тварин позитивно Показники РН ВХА Біопроба Реагув. Кількість Реагув. Реагув. Кількість Вірус Вірус не негапозинегавиділ. у видітварин тварин тивно тивно тивно тварин лили 4-5 21 15 21 15 0 0 21 15 21 15 0 0 15 12(80%) 3 24-36 7 7 0 7 7 0 7 6(83%) 1 24-36 15 15 0 15 15 0 1 1 0 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 34 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 4