Тест-система імуноферментна для визначення антитіл класу g до вірусу простого герпесу і типу у мишей

Реферат: Тест-система імуноферментна для визначення антитіл класу G до вірусу простого герпесу 1 типу у мишей, причому імуносорбент виготовлено на основі рекомбінантного білка gGl-GST і в складі пероксидазного кон'югату використовуються козячі поліклональні антитіла анти-IgG мишей. UA 73526 U (12) UA 73526 U UA 73526 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, імунохімії та медицини і може бути використана для визначення антитіл до вірусу простого герпесу 1 типу у мишей. Моделювання перебігу вірусних інфекцій на дослідних тваринах є важливою ланкою при вивченні даних збудників та розробленні заходів боротьби з ними. Одним з об'єктів сучасних досліджень є вірус простого герпесу 1 типу - збудник чисельних захворювань людини. Відтворення герпетичних захворювань слизових оболонок та ЦНС на мишах дозволяє всебічно вивчити процеси розвитку інфекції та формування імунної відповіді, способи лікування та вплив протигерпетичних препаратів. Зокрема, одним з аспектів є відстеження динаміки антитілоутворення, а найпоширенішим методом дослідження сероконверсії є імуноферментний аналіз. Відома тест-система для виявлення антитіл класу G до простого герпесу 1 та 2 типу в сироватках і плазмі крові людини [1]. В основі тест-системи лежать рекомбінантний антиген аналог нативного антигену простого герпесу 1 та 2 типу, який використано у складі імуносорбенту, та мишачі моноклональні антитіла до імуноглобуліну класу G людини у складі кон'югату. В основу корисної моделі поставлено задачу створити імуноферментну тест-систему на основі рекомбінантного білка gGl-GST ВПГ1 вітчизняного виробництва та козячих поліклональних антитіл до імуноглобулінів G мишей з можливістю визначення в форматі даної тест-системи антитіл до вірусу простого герпесу 1 типу у мишей. Поставлена задачі в форматі корисної моделі вирішують шляхом використання сконструйованого бактеріального продуцента рекомбінантного білка gGl-GST, антигенного аналога вірусного білка G ВПГ1, який забезпечує високу чутливість аналізу. Також використано специфічний пероксидазний кон'югат для виявлення імунних комплексів, виготовлений на основі козячих поліклональних антитіл до IgG мишей. На підставі цих даних було розроблено імуноферментну тест-систему для виявлення імуноглобулінів класу G до вірусу простого герпесу 1 типу у мишей. Тест-систему сконструйовано за принципом імуноферментного аналізу. Як тверду фазу використовували полістиролові планшети PolySorp (Nunc, Данія). В лунки планшетів сорбували рекомбінантний білок gGl-GST, антигенний аналог глікопротеїну G вірусу простого герпесу 1 типу. Постановку ІФА проводили двохетапно. В лунках імуносорбенту досліджувані зразки сироваток крові мишей розводили 1:10 буфером для розведення зразків. Буфер для розведення зразків являє собою фізіологічний розчин з додаванням лізату клітин Ε. colli, екстракту молока та детергенту Tween 20, як компонентів, що блокують неспецифічний сигнал. Розробка тест-системи та використання її в експериментальних дослідженнях пояснюється наступними прикладами. Приклад 1 Герпетичну інфекцію створювали на мишах лінії Balb/C шляхом інтраперитонеального введення вірусу простого герпесу 1 типу (ВПГ1) в дозі LD20- Було проаналізовано 15 зразків сироваток крові мишей, отриманих на 21 добу після зараження ВПГ1. Забір зразків для аналізу проводили на 21 добу після зараження мишей ВПГ1. Усі зразки тестували у двох повторах, статистичну обробку результатів проводили згідно з критерієм Стьюдента. Визначення проводять згідно з відомою методикою [2] твердофазного імуноферментного аналізу. Для цього вносять у лунки планшета з фіксованим на ньому рекомбінантним білком gGl-GST ВПГ1 по 90 мкл розчину для розведення сироваток та по 10 мкл досліджуваних сироваток крові від заражених мишей. Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та інкубують при температурі 37 °С протягом 60 хв. При наявності в зразку антитіл до вірусного антигену вони зв'язуються з рекомбінантними антигенами на твердій фазі, утворюючи комплекс антиген-антитіло. Після відмивання планшету в лунки додають кон'югат поліклональних антитіл проти IgG мишей, які мічено пероксидазою, і інкубують при 37 °С протягом 30 хв. Після відмивання шість разів в лунки додають по 100 мкл розчину проявника (субстратний буфер з хромогеном) та інкубують при 18-22 °С у темряві 30 хв. Зупиняють кольорову реакцію, вносячи до всіх проб по 50 мкл стоп-реагенту. Не більш як через 5 хв. після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі за допомогою спектрофотометра. Результат аналізу вважається позитивним, якщо ОГ досліджуваного зразка більше граничного значення. Значення ОГ зразка прямо пропорційне кількості специфічних антитіл. Специфічні антитіла до ВПГ було виявлено в усіх 15 зразках, що свідчить про розвиток гуморальної імунної відповіді після контакту з вірусом. Приклад 2 1 UA 73526 U 5 Визначення наявності антитіл до вірусу простого герпесу 1 типу в сироватці крові інтактних мишей лінії Balb/C (10 тварин). Дослідження зразків проводили за методикою, описаною в прикладі 1. В контрольній групі інтактних мишей (10 тварин) антитіла до ВПГ1 не виявлено. Таким чином чутливість та специфічність розробленої тест-системи становить 100 % ( таблиця). Таблиця Результати виявлення антитіл до вірусу простого герпесу 1 типу у мишей Миші, заражені ВПГ Інтактні миші 10 15 20 25 № тварини 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 ОГ 2,15 1,98 1,92 2,3 2,01 1,98 1,69 1,35 2,3 2,49 2,05 1,87 1,65 2,4 2,36 0,03 0,009 0,01 0,006 0,008 0,009 0,007 0,01 0,008 0,02 ОГ/cut off 16,8 15,5 15,0 18,0 15,7 15,5 13,2 10,5 18,0 19,5 16,0 14,6 12,9 18,8 18,4 0,2 0,1 0,1 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 Результат позитивний позитивний позитивний позитивний позитивний позитивний позитивний позитивний позитивний позитивний позитивний позитивний позитивний позитивний позитивний негативний негативний негативний негативний негативний негативний негативний негативний негативний негативний Крім того, було проаналізовано динаміку антитілоутворення у 3 груп мишей (по 10 тварин в кожній) інфікованих ВГТГ1 в дозах LD10, LD20 та LD30. Відбір зразків крові здійснювали до зараження ВПГ1, а також на 7, 14 та 21 добу після контакту з вірусом. В усіх зразках, отриманих після введення вірусу, підтверджено наявність специфічних антитіл, і крім того спостерігається найвища оптична густина в зразках, отриманих на 21 добу після зараження мишей ВПГ1 (Діаграма). Такі результати свідчать про збільшення кількості антитіл і узгоджуються з літературними даними. Отже, використання розробленої нами тест-системи також дозволяє відстежувати сероконверсію (динаміку антитілоутворення) при герпетичній інфекції у мишей. Приклад 3 Визначення динаміки антитілоутворення у трьох груп мишей лінії Balb\C (по 10 тварин в кожній) при інтраперитонеальному введенні вірусу простого герпесу 1 типу. Відбір зразків крові здійснювали до контакту з ВПГ1, а також на 7, 14 та 21 добу після введення вірусу. В усіх зразках, отриманих після імунізації, підтверджено наявність специфічних антитіл, і крім того спостерігається найвища оптична густина в зразках, отриманих на 21 добу після інфікування мишей ВПГ1. Такі результати свідчать про збільшення кількості антитіл і узгоджуються з літературними даними [3]. Отже, використання розробленої нами тест-системи дозволяє відстежувати сероконверсію (динаміку антитілоутворення) при герпетичній інфекції у мишей. Крім того дана тест-система є простою і надійною в роботі, проявляє високу чутливість та специфічність. Використана література 1. Інструкція по використанню імуноферментної тест-системи «Dia-HSV1\2 IgG» виробництва Нижній Новгород, (Росія). - 2010. - 7 с. 2 UA 73526 U 2. Співак М.Я. та ін. Практичний посібник з імуноферментного аналізу. - Київ, 2003. - 48 с. 3. Mester J.C., Rouse B.T. The mouse model and understanding immunity to herpes simplex virus // Reviews of infectious diseases Vol. 13, Now. -Dec, 1991. 5 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 Тест-система імуноферментна для визначення антитіл класу G до вірусу простого герпесу І типу у мишей, яка відрізняється тим, що імуносорбент виготовлено на основі рекомбінантного білка gGl-GST і в складі пероксидазного кон'югату використовуються козячі поліклональні антитіла анти-IgG мишей. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3