Композиція дефібротиду та гемопоетичного фактора для збільшення кількості стовбурових клітин, спосіб її приготування

Даний винахід відноситься до області медицини і, зокрема, композиції, здатної збільшувати кількість стовбурних клітин і клітин-попередників у циркуляції периферичної крові в ссавців. Запропонована композиція відрізняється тим, що вона містить дефібротид у комбінації принаймні з одним гемопоетичним фактором, що має здатність активувати гемопоетичні клітини-попередники, переважно G-CSF. Можливість одержання підвищеної кількості стовбурних клітин і клітин-попередників у циркуляції периферичної крові в ссавців, і, зокрема, у людини, протягом багатьох літ була предметом інтенсивних досліджень. Доступність стовбурних клітин і/чи клітин-попередників є дуже важливою в таких областях, як автогенна трансплантація циркулюючих клітин-попередників, алотрансплантація циркулюючих клітинпопередників і генна терапія циркулюючих гемопоетичних клітин. Хоча після народження стовбурні клітини й клітини-попередники знаходяться майже винятково в кістковому мозку, " проте, вони мають міграційні властивості; тобто іншими словами, у фізіологічних умовах вони мігрують через порожнини кісткового мозку й утягуються у циркуляцію. Цей процес, звичайно відомий як «активація», може бути посилений у ссавців за рахунок різних обробок, таких як, наприклад, уведення цитокінів, і особливо фактора росту колоній гранулоцитів (G-CSF). Зворотний процес, відомий як «хоумінг», відбувається, наприклад, в опромінених реципієнтів після трансплантації гемопоетичних клітин. Однак механізм, що лежить в основі активації і хоумінгу, залишається ще неясним. [C.F. Craddock et al. "Antibodies to VLA4 Integrin Mobilize Long-Term Repopulating Cells and Augment Cytokine-Induced Mobilization in Primates and Mice", Blood, Vol. 90, № 12, 1997, pp. 4779-4788/ F. Prosper et al. Mobilization and , Homing of Peripheral Blood Progenitors in Related to Reversible Downregulation of α4β1 Integrin Expression and Function", J Clin. Invest., Vol. 101, № 11, 1998, pp. 2456-2467; M. Vermeulen et al., "Role of Adhesion Molecules in the Homing and Mobilization of Murine Heraatopoietic Stem and Progenitor Cells", Blood, Vol. 92, № 3, 1998, pp. 894-900]. Фактор G-CSF [реєстраційний номер CAS 143011-2-7/Merck Index, 1996, стор. 4558] являє собою гемопоетичний фактор росту, що незамінний при проліферації й диференціації клітин-попередників гранулоцитів. Він є глікопротеїном із молекулярною масою 18-22 кд і звичайно утворюється у відповідь на специфічну стимуляцію під дією множини клітин, що включають моноцити, фібробласти та ендотеліальні клітини. Термін дефібротид (DEF) [реєстраційний номер CAS 83712-60-1] означає полідезоксирибонуклеотид, отриманий екстракцією [US 3770720 і US 3899481] тварин і/чи рослинних тканин. Звичайно, цей полідезоксирибонуклеотид застосовується у вигляді солі лужного металу, звичайно, натрію. Дефібротид звичайно використовують у зв'язку з його антитромботичною активністю [US 3829567], хоча його можна застосовувати й в інших, областях, наприклад, при лікуванні гострої ниркової недостатності [US 4694134] і гострої ішемічної хвороби міокарда [US 4693995]. Нарешті, у US 4985552 і US 5223609 описаний спосіб одержання дефібротиду, що забезпечує одержання продукту з постійними і добре визначеними фізикохімічними властивостями, що не має будь-яких побічних ефектів. У контексті цього винаходу термін дефібротид означає будь-який олігонуклеотид і/чи полінуклеотид, отриманий екстракцією тварин і/чи рослинних тканин, зокрема, органів ссавців. Переважно, дефібротид одержують у відповідності зі способами, описаними в зазначених вище патентах, які, таким чином, необхідно розглядати як складову частину цього винаходу. Ще більш переважно, дефібротид одержують відповідно до способів, описаних у патентах США №№ 4985552 і 5223609. У даному винаході зненацька було виявлено, що активацію стовбурних клітин і клітин-попередників можна збільшити шляхом уведення дефібротиду в комбінації і/чи в безпосередній часовій близькості з гемопоетичним фактором, що має здатність активувати гемопоетичні клітини-попередники. Як можна буде оцінити з прикладів, уведення дефібротиду в комбінації і/чи в безпосередній часовій близькості з гемопоетичним фактором, що має здатність активувати гемопоетичні клітини-попередники, дозволяє досягти набагато більш високого ступеня активації, ніж у випадку введення одного гемопоетичного фактора. Отже, предмет цього винаходу включає композицію, що містить як активні інгредієнти дефібротид у комбінації принаймні з одним гемопоетичним фактором, що має здатність активувати гемопоетичні клітинипопередники, переважно G-CSF. У кращому варіанті здійснення запропонована композиція являє собою водяний розчин для ін'єкції; альтернативно композиція може являти собою два різних розчини, один із яких містить дефібротид, а інший гемопоетичний фактор, що має здатність активувати гемопоетичні клітинипопередники. Тому композиція, згідно з даним винаходом, має форму об'єднаного препарату для одночасного, роздільного чи послідовного застосування зазначених вище активних інгредієнтів для збільшення кількості стовбурних клітин і/чи гемопоетичних клітин-попередників у циркуляції у периферичній крові ссавців. Другий аспект даного винаходу включає застосування дефібротиду в комбінації принаймні з одним гемопоетичним фактором, що має здатність активувати гемопоетичні клітини-попередники, для одержання композицій, здатних збільшити кількість стовбурних клітин і/чи гемопоетичних клітин-попередників у циркуляції у периферичній крові ссавців, зокрема, людину. Нарешті, ще один предмет цього винаходу включає спосіб збільшення кількості стовбурних клітин і/чи гемопоетичних клітин-попередників у циркуляції у периферичній крові ссавців, що полягає у введенні дефібротиду в комбінації і/чи в безпосередній часовій близькості принаймні з одним гемопоетичним фактором, що має здатність активувати гемопоетичні клітини-попередники. У якості гемопоетичного фактора, використовуваного при розробці даного винаходу, був використаний G-CSF. Однак не виключено, що аналогічні результати можуть бути отримані з гемопоетичними факторами, що відрізняються від G-CSF, які, однак, мають здатність активувати гемопоетичні клітини-попередники, наприклад, такими як фактор росту колоній гранулоцитів і макрофагів (GM-CSF) , «Flt3 лігандЗ (FL)», «фактор стовбурних клітин» (SCF), тромбопоетин (ТРО), інтерлейкін 8 (IL-8) і інші, що без сумніву ясно для фахівців у цій області техніки. Як дефібротид, застосовуваний у комбінації з G-CSF на першій експериментальній стадії, був використаний дефібротид, що випускається фірмою Crinos Spa під товарним знаком Proclicide ™, одержаний відповідно до способу, описаному в US. 4985552 і US 5223609. Що стосується способів уведення цих двох активних компонентів, вони не обмежуються задачами даного винаходу. Іншими словами, дефібротид і гемопоетичний фактор, що має здатність активувати гемопоетичні клітини-попередники, можна вводити ссавцям (і, зокрема, людині) у відповідності зі способами та нозологією, що відомі в цій області техніки. Звичайно, їх уводять перорально, внутрішньом'язово, внутрішньочеревинно, підшкірно чи внутрішньовенно, причому останній спосіб є кращим. Крім того, ці два активних інгредієнти можуть бути введені одночасно чи послідовно. Іншими словами, у першому випадку їх уводять у вигляді простої композиції, що містить - обох активних інгредієнтів і в яку необов'язково, але можна додати звичайні лікарські ексцепієнти і/чи ад'юванти, відомі в цій області. Альтернативно, обоє активних компонентів можна вводити послідовно, а саме у вигляді двох різних композицій, одна з яких містить гемопоетичний фактор, що має здатність активувати гемопоетичні клітинипопередники, переважно G-CSF, а інша містить дефібротид. Звичайно, G-CSF уводять підшкірно в кількості від 5 до 24 мкг/кг, у той час як дефібротид (DEF) уводять шляхом безупинного уливання в кількості від 5 до 15 мг/кг у годину протягом 2-7 діб. Як можна буде оцінити з наведених прикладів, які варто розглядати тільки як ілюстрації, що не обмежують цей винахід, уведення G-CSF у комбінації з дефібротидом мишам, що є найбільш розповсюдженою експериментальною моделлю ссавців, і мавпам дозволяє досягти набагато більш високого ступеня активації, ніж у випадку введення одного G-CSF, із чіткими перевагами для всіх тих областей терапії, де бажаним є високий рівень активації. Перелік фігур На Фігурі 1 показана кінетика числа лейкоцитів (WBC). На Фігурі 2 показане число клітин, що утворюють колонії (CFC), у периферичній крові. На Фігурі 3 показана частота клітин, що утворюють колонії (CFC), у периферичній крові. На Фігурі 4 показані рівні CFC на 5 добу терапії. На Фігурі 5 показана частка CFC на 5 добу терапії. На Фігурі б показана кінетика клітин, що стимулюють колонії з високою проліферативною активністю (HPP-CFC). Відомості, що підтверджують можливість здійснення винаходу Приклад 1 Цей експеримент проводять для того, щоб оцінити вплив уведення G-CSF і/чи дефібротиду на число лейкоцитів (WBC) , що є присутніми у крові мишей. Мишам BALB/c у віці від 6 до 8 тижнів із масою тіла від 20 до 25г внутрішньочеревинно (IP) ін'єктувала C-CSF (5 мкг/миша в добу), дефібротид (1 мг/миша в добу) чи GCSF (5 мкг/миша в добу) у комбінації зі зростаючими дозами дефібротиду (1, 10, 15 мг/миша в добу). Контрольній групі мишей, що не одержували G-CSF чи дефібротид, внутрішньочеревинно ін'єктували PBS, що містив до 1% мишачого сироваткового альбуміну (PBS/MSA). Мишей обробляють протягом 5 діб й умертвляють через 3 чи 5 діб обробки, чи через 3 доби після припинення терапії. Результати цього експерименту наведені на фіг.1. Для представлення кожної групи мишей використані наступні символи: G-CSF (¾) (n= 24), дефібротид 1 (о) (п = 3), G-CSF+ дефібротид 1 (¿) (п=13), G-CSF+дефібротид 10 (p) (п=s), GCSF+ дефібротид 15 (·) (п=23). Середнє число лейкоцитів для контрольної групи мишей (PBS/MSA) складало 2,87 ± 0,2 * 106 / мл крові; дані виражені як середня величина ± стандартна помилка середнього (SEM). Приклад 2 Кінетика активації клітин, що утворюють спільні колонії (CFC), у 1 мл крові мишей із приклада 1. Середнє число клітин CFC у PBS/MSA для контрольної групи мишей складало 39 ± 12 на 1 мл крові; дані наведені на фіг. 2 і виражені як середня величина ± стандартна помилка середнього (SEM), що отримані з дубльованих культур на зразках для кожної тварини в даний момент часу. Приклад 3 Зміни частоти сумарної кількості клітин, що утворюють спільні колонії (CFU-GM + BFU-E + CFU-Mix + HPPCFC) на 105 клітин, покритих шаром кров'яного згустку периферичної крові, у мишей, згаданих у прикладі 1. Середнє число клітин CFC у - PBS/MSA для контрольної групи мишей складало 3,5 ± 1; дані наведені на фіг. З і виражені як середня величина ± стандартна помилка середнього (SEM), що отримані з дубльованих культур на зразках із кожної тварини в даний момент часу. Приклад 4 Сумарне число клітин, що утворюють спільні колонії (CFU-GM + BFU-E + CFU-Mix + HPP-CFC) на 1 мл крові через 5 діб обробки мишей із приклада 1; дані наведені на фіг. 4 і виражені як середня величина ± стандартна помилка середнього (SEM), що отримані з дубльованих культур на зразках із кожної тварини. Приклад 5 Частота сумарної кількості клітин, що утворюють спільні колонії (CFU-GM + BFU-E + CFU-Mix + HPP-CFC) для Ю5 клітин, покритих шаром кров'яного згустку периферичної крові, у мишей, згаданих у прикладі 1/ дані наведені на фіг. 5 і виражені як середня величина ± стандартна помилка середнього (SEM), що отримані з дубльованих культур на зразках із кожної тварини. Приклад 6 Цей експеримент проводять для того, щоб оцінити вплив від уведення G-CSF і/чи дефібротиду на кількість гемопоетичних клітин-попередників/стовбурних клітин (клітини, що стимулюють колонії з високою проліферативною активністю чи HPP-CFC) у циркуляції у периферичній крові мавп. Дослідження проводили на макаках-резусах (Масаса mulatta) у віці 4-6 років, що мають добре здоров'я і нормальні показники гематології і клінічної хімії. Фактор G-CSF уводили підшкірно, 100 мкг/кг, протягом 5 діб, у двох циклах. Дефібротид уводили зі швидкістю 15 мкг/кг у годину за допомогою системи безупинної інфузії протягом 5 діб, на другому циклі. Тварин піддавали анестезії для забору крові, уведення G-CSF і зміни пакета -ліків. Результати цього експерименту наведені на фігурі б, із якої можна оцінити, що введення G-CSF у комбінації з дефібротидом. забезпечує рівень активації HPP-CFC у мавп, який приблизно в 8 разів вище у порівнянні з рівнем, що досягається при введенні одного G-CSF. ВИСНОВКИ З даних, наведених на фіг.1, випливає, що введення G-CSF у комбінації з дефібротидом приводить до істотного збільшення кількості лейкоцитів у циркулюючій крові мишей. Зокрема, слід зазначити, що введення одного дефібротиду не впливає на кількість лейкоцитів у циркуляції крові. Отже, комбінація G-CSF і дефібротиду має несподіваний ефект (який залежить від дози) - приводить до збільшення числа лейкоцитів, причому цей ефект не є простою сумою двох відгуків, що не залежать друг від друга. Фігури 2-5 ясно демонструють, що введення G-CSF у комбінації з дефібротидом забезпечує рівень активації у мишей, який набагато вище (від 10 до 100 разів) , ніж рівень активації, отриманий при введенні одного G-CSF. Нарешті, фіг. б підтверджує, що введення G-CSF у комбінації з дефібротидом забезпечує рівень активації стовбурних клітин (HPP-CFC) у мавп, який приблизно в 8 разів вище у порівнянні з рівнем, що досягається при введенні одного G-CSF. Ефект спільного введення двох активних інгредієнтів залежить від дози, оскільки рівень активації зростає пропорційно кількості введеного дефібротиду; у всіх випадках пік найвищої активації досягається приблизно на п'яту добу після введення.