Спосіб визначення достатньої протимікробної активності лікарських засобів до біоплівок грибів

Реферат: Спосіб визначення достатньої протимікробної активності лікарських засобів до біоплівок грибів включає вимірювання показників змін процесу життєдіяльності біоплівок грибів, у якому вимірюють зміну експресії генів, пов'язаних з утворенням біоплівок, під час дії антигрибкового препарату. UA 74272 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ДОСТАТНЬОЇ ПРОТИМІКРОБНОЇ АКТИВНОСТІ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ ДО БІОПЛІВОК ГРИБІВ UA 74272 U UA 74272 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до мікології та фармакології, та може бути використана для визначення достатньої протимікробної активності лікарських засобів до біоплівок грибів. Визначення протимікробної активності лікарських засобів до біоплівок грибів для вибору найбільш ефективних з них для лікування інфекцій, які викликаються цими грибами, є важливою задачею мікології та фармакології. Для визначення протимікробної активності протимікробних засобів до біоплівок грибів застосовують наступні методи: прямий підрахунок клітин за допомогою мікроскопії при довжині хвилі 450 нм, висів біоплівок на щільне середовище Сабуро для підрахунку кількості колонієутворюючих одиниць (КУО) та визначення мінімальної пригнічуючої концентрації (МПК) протимікробного засобу за допомогою вимірювання рівня асиміляції глюкози із середовища життєздатними клітинами біоплівки [Пат. № 55114 U Україна. Спосіб визначення протимікробної активності лікарських засобів до біоплівок грибів Candida albicans / Білозоров О.П., Частій Т.В., Васильченко В.М.; ДУ" ІДіВ АМНУ". Опубл. 10.12.2010]. Даний спосіб визначення достатньої протимікробної активності лікарських засобів до біоплівок грибів є найбільш близьким аналогом до способу, що заявляється. Основним недоліком найближчого аналога є його недостатня точність та достовірність у відношенні ліпосомальних антимікробних препаратів у зв'язку з тим, що ліпосоми є не розчином, а дисперсією, і спотворюють показання оптичної щільності і таким чином знижується достовірність визначених МПК протимікробних засобів. Крім того, дослідження впливу протигрибкових препаратів на процеси утворення біоплівок визначенням переважно морфологічних показників недостатньо характеризують зміни процесу життєдіяльності під впливом антимікотиків. В основу корисної моделі поставлено задачу, що полягає у підвищенні ефективності способу визначення достатньої протимікробної активності лікарських засобів до біоплівок грибів та розширення арсеналу засобів для цього. Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення достатньої протимікробної активності лікарських засобів до біоплівок грибів, що включає вимірювання показників змін процесу життєдіяльності біоплівок грибів, згідно з корисною моделлю, вимірюють зміну експресії генів, пов'язаних з утворенням біоплівок, під час дії антигрибкового препарату, і, якщо експресія гену зменшується в 10 разів та більше, лікарський засіб визнають як засіб з достатньою мікробною активністю. Технічний ефект корисної моделі обумовлений тим, що вимір змін експресії генів, пов'язаних з утворенням біоплівок грибів, під час дії антимікотичних засобів є більш точним показником по відношенню до відомих способів визначення протимікробної активності лікарських засобів за рахунок того, що на цей показник не впливають екзогенні та ендогенні чинники. Спосіб виконують наступним чином. Для культивування грибів, зокрема Candida, використовують рідке живильне середовище, яке містить (вага/об'єм) 1 % дріжджового екстракту, 2 % пептону, 2 % глюкози (середовище ДЕПГ). Культуру С. інкубують на рідкому ДЕПГ протягом 18 год. при 32 °C. Клітини збирають центрифугуванням при 4000 об/хв. протягом 10 хв., відмивають стерильним рідким ДЕПГ і 6 розводять цим середовищем до концентрації 1,0×10 КУО/мл. Концентрацію КУО гриба встановлюють спектрофотометрично на підставі побудованої попередньо калібрувальної кривої залежності оптичної щільності від кількості КУО, визначеної шляхом висіву серійних розведень на щільне середовище Сабуро. Біоплівки С. одержують в планшетах для імунологічних досліджень. В кожну лунку планшету 6 вносять по 100 мкл стандартизованої суспензії клітин С. (100 мкл 10 КУО/мл) і інкубують протягом 48 год. при 32 °C. Після утворення біоплівки середовище відсмоктують піпеткою і клітини, що прикріпилися до дна, видаляють промивкою тричі стерильним забуференим фізіологічним розчином. Залишок розчину видаляють смужкою фільтрувального паперу. Протимікробні засоби розводять методом двократних серійних розведень рідким живильним середовищем ДЕПГ із концентрованих розчинів в окремому планшеті і по 100 мкл відповідного розведення вносять в лунки планшета і інкубують додатково протягом 24 год. Після цього живильне середовище відсмоктують, біоплівки промивають як описано вище і до них додають по 100 мкл в кожну лунку стерильного рідкого живильного середовища ДЕПГ. Контролем є лунки з біоплівками без протимікробного засобу. Планшети додатково інкубують при 32 °C протягом 24 год. Через 24 години інкубації антимікотиків з біоплівками відбирають планктонні клітини, біоплівки промивають від препарату та планктонних клітин та ретельно знімають зі дна чашки за допомогою стерильного гумового шпателя. Теж саме виконують і з контрольною культурою. На цьому етапі визначають експресію гену МЕТ3 як в планктонних клітинах, так і 1 UA 74272 U 5 10 15 20 фіксованих на твердій фазі біоплівках грибів Candida. Ген МЕТ3 є одним із ключових генів, що контролюють утворення біоплівок грибів. Виділення РНК із біоплівок проводять фенольним методом. Отримані зразки РНК піддають реакції зворотної транскрипції для одержання кДНК. Клітини гомогенізують в гуанідиновому реагенті, після чого розчин тричі екстрагують кислим фенолом і хлороформом, осаджують етанолом і розчиняють у воді. Для постановки реакції використовують зворотну транскриптазу M-MLV [Genome-wide transcription profiling of the early phase of biofilm formation by Candida albicans/ Murillo LA, Newport G, Lan CY et.al // Eukaryot Cell. 2005. - V.4. - № 9. - P.1562-1573], риболок, праймери npmet3:5'-ACACCTGAGTTGACTCCA-3’ / 5’ACACCTGAGTTGACTCCA-3’, трифосфати. Далі, після одержання кДНК, проводять полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) на фрагмент гена МЕТ3 із зазначеними вище праймерами і Taqполімеразою. Режим ампліфікації (для мутації 2282del4) включaє температурний режим: 1 цикл 50 °C 30 хв., 95 °C 2 хв., 35 циклів 94 °C 15 сек., 95 °C 15 сек., 50 °C 30 сек., і 1 цикл 72 °C 1 хв. Продукти ПЛР аналізують електрофорезом в 1,0 % агарозному гелі і досліджують на трансiлюмінаторі при світлі довжиною 310 нм. Позитивну реакцію визначають появою амплікону - фрагменту гена МЕТ3 довжиною 295 нм. Наявність або відсутність екпресії гена МЕТ3 визначають за наявністю або відсутністю амплікону - фрагменту гена МЕТ3. Ефективність способу встановлена експериментально. В порівняльних дослідженнях були визначені МПК тербінафіну (антимікотик, який застосовується в мікології) і бензоїлу пероксиду (дезінфікуючий агент з широким спектром дії) по відношенню до біоплівок грибів С. albicans як способом наявності або відсутності амплікону - фрагменту гена МЕТ3, так і способом оцінки рівня пригнічення ними здатності біоплівок до асиміляції глюкози (АГ). Результати приведені в таблицях 1 і 2. Таблиця 1 МПК в мкг/мл тербінафіну і бензоїлу пероксиду, а також їх ліпосомальних форм, одержаних на основі лецитину, визначені за допомогою способу, що заявляється: по наявності або відсутності амплікону - фрагменту гена МЕТ3 (експресія гена МЕТ3) і способу асиміляції глюкози (АГ) Ліпосомальний тербінафін Ліпосомальний бензоїлу Бензоїлу пероксид на основі лецитину пероксид на основі лецитину експресія експресія експресія експресія АГ АГ АГ АГ гену МЕТ3 гену МЕТ3 гену МЕТ3 гену МЕТ3 не не 256,0 256,0 32,0 290,0 290,0 64 визначається визначається Тербінафін 25 Таблиця 2 МПК в мкг/мл тербінафіну і бензоїлу пероксиду, а також їх ліпосомальних форм, одержаних на основі негативно заряджених ліпідів, визначені за допомогою способу, що заявляється: по наявності або відсутності амплікону - фрагменту гена МЕТ3 (експресія гену МЕТ3) і способу асиміляції глюкози (АГ) Тербінафін Негативно заряджені ліпосоми з бензоїл пероксидом експресія експресія АГ АГ гену МЕТ3 гену МЕТ3 не 290,0 290,0 52 визначається Негативно заряджені ліпосоми з тербінафіном експресія гену МЕТ3 АГ експресія гену МЕТ3 АГ 256,0 256,0 24,0 Бензоїлу пероксид не визначається Як видно із даних, наведених в таблицях 1 і 2, спосіб, що заявляється, є ефективним методом визначення достатньої протимікробної активності лікарських засобів до біоплівок грибів. 30 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб визначення достатньої протимікробної активності лікарських засобів до біоплівок грибів, що включає вимірювання показників змін процесу життєдіяльності біоплівок грибів, який 2 UA 74272 U відрізняється тим, що вимірюють зміну експресії генів, пов'язаних з утворенням біоплівок, під час дії антигрибкового препарату, і, якщо експресія гену зменшується в 10 разів та більше, лікарський засіб визнають як засіб з достатньою мікробною активністю. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3