Спосіб виявлення та оцінки оксидативного стресу в сперматозоїдах еякуляту

Реферат: Спосіб виявлення та оцінки оксидативного стресу в сперматозоїдах еякуляту включає мікроскопічну оцінку забарвлення в реакції зв'язування та відновлення нітросинього тетразолію до депозитів диформазану темно-синього кольору під впливом активних форм кисню при оксидативному стресі. Визначають в забарвлених препаратах еякуляту процентний вміст диформазанпозитивних сперматозоїдів. Збільшення відсотка диформазанпозитивних сперматозоїдів, що містять малі, великі та дрібні темно-сині депозити відновленого дифармазану і займають більше 50 % цитоплазми сперматозоїда, свідчить про кількість сперматозоїдів, що перебувають в стані оксидативного стресу. UA 74765 U (12) UA 74765 U UA 74765 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до урології та клінічної імунології і може бути використана для виявлення та оцінки оксидативного стресу в сперматозоїдах еякуляту. Відомо, що оксидативний стрес є однією з важливих характеристик еякуляту. Під впливом оксидативного стресу в сперматозоїдах активується перекисне окислення ліпідів плазматичної мембрани, ушкоджується структура мітохондріальної та геномної ДНК. Оксидативний стрес розвивається внаслідок "респіраторного вибуху" - різкого посилення кисневого метаболізму в активованих клітинах, результатом якого є утворення первинних (О 2 супероксидний аніон, 1 1 перекис водню Н2О2, гідроксильний радикал ОН, синглетний кисень q і q+) та вторинних метаболітів (гіпохлорна кислота НОСІ, гіпохлорид СІО хлорамін, продукти перикисного окислення ліпідів) активних форм кисню за участю ферментів гексозомонофосфатного шунта, а саме НАДФН-оксидазної системи (NADPH-oxidase). Найбільш повно функціонування ферментів НАДФН-оксидазної системи описано для лейкоцитів, проте визначено, що подібні до лейкоцитарних, але з меншою активністю, вони присутні в багатьох типах клітин, у тому числі і в сперматозоїдах. При цьому ушкодження сперматозоїдів активними формами кисню під час оксидативного стресу відіграє істотну роль в патогенезі чоловічої неплідності. Відомо, що для оцінки оксидативного стресу в еякуляті є luminol-залежний хемілюмінесцентний метод. [1], який включає визначення співвідношення активної форми кисню до антиоксидантної активності, тобто представлена повна характеристика неферментативної антиоксидантної активності та продукції активних форм кисню в еякуляті на luminometerприладі. Недоліком способу є те, що показник, оксидативного стресу в еякуляті отримують хемілюмінесцентним методом на luminometer-приладі, що обмежує широке використання методу в клінічній практиці, та не розраховують цей показник для лейкоцитів і сперматозоїдів в еякуляті. Відомий також спосіб оцінки оксидативного стресу в лейкоцитах крові у хворих на хронічні захворювання легень за допомогою нітросинього тетразолію [2], який взятий за прототип, заснований на реакції зв'язування та відновлення нітросинього тетразолію до депозитів диформазану темно-синього кольору під впливом активних форм кисню при оксидативному стресі при мікроскопічному дослідженні лейкоцитів крові. Недоліком способу є те, що спосіб використовують тільки для мікроскопічної оцінки оксидативного стресу в лейкоцитах крові. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб виявлення та оцінки оксидативного стресу в сперматозоїдах еякуляту шляхом мікроскопічного визначення в забарвлених препаратах еякуляту процентного вмісту сперматозоїдів, що містять малі, великі та дрібні темно-сині депозити відновленого дифармазану і займають більше 50 % цитоплазми сперматозоїда, а збільшення їх відсотка, свідчить про кількість сперматозоїдів, що перебувають в стані оксидативного стресу і може бути додатковим інформативним показником зниження фертильних властивостей еякуляту при екскреторно-токсичному неплідді. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб виявлення та оцінки активності оксидативного стресу в сперматозоїдах еякуляту, що включає мікроскопічну оцінку забарвлення в реакції зв'язування та відновлення нітросинього тетразолію до депозитів диформазану темносинього кольору під впливом активних форм кисню при оксидативному стресі, згідно з корисною моделлю, визначають в забарвлених препаратах еякуляту процентний вміст диформазанпозитивних сперматозоїдів, при цьому збільшення відсотка диформазанпозитивних сперматозоїдів, що містять малі, великі та дрібні темно-сині депозити відновленого дифармазану і займають більше 50 % цитоплазми сперматозоїда, свідчить про кількість сперматозоїдів, що перебувають в стані оксидативного стресу. Спосіб виявлення та оцінки оксидативного стресу в сперматозоїдах виконують наступним чином: в скляну центрифугальну пробірку напівавтоматичною піпеткою з наконечником разового використання додають 100 мікролітрів еякуляту та 100 мікролітрів 0,1 % розчину нітросинього тетразолію у фосфатному буфері (рН 7,2-7,4), проби ретельно розмішують та витримують 30 хвилин в термостаті при t 37 °C. На знежиреному предметному склі змішують краплю проби з пробірки, додають краплю еозину (3 % розчин на дистильованій воді), добре розмішують та через 1 хвилину за допомогою пластикового шпателя або накривного скла легким рухом роблять мазок. Мазки повинні бути тонкими, рівномірними, займати не більше 2/3 предметного скла і закінчуватися "щіточкою". Мазок висушують на повітрі. Підрахування відсотка сперматозоїдів, які містять гранули диформазану темно-синього кольору, проводять під імерсійним об'єктивом (900 або 1000). Забарвлення мазка - оранжево-червоний колір. Диформозанпозитивними вважають такі сперматозоїди, що містять малі, великі та дрібні темносині депозити відновленого дифармазану і займають більше 50 % цитоплазми сперматозоїда. 1 UA 74765 U 5 10 15 Практичне використання способу, що пропонується, проведено в лабораторії імунології та відділі сексопатології та андрології ДУ "Інститут урології НАМИ України". Визначення показників оксидативного стресу в сперматозоїдах проведено у 83 чоловіків репродуктивного віку (25-45 років), хворих на хронічний простатит, ускладнений екскреторно-токсичним непліддям. Визначення продукції активних форм кисню сперматозоїдами за показниками мікроскопічної оцінки реакції зв'язування та відновлення нітросинього тетразолію до депозитів диформазану темно-синього кольору наведені в таблиці. Як свідчать наведені в таблиці дані, за показниками мікроскопічної оцінки реакції зв'язування та відновлення нітросинього тетразолію до депозитів диформазану темно-синього кольору, для сперматозоїдів еякуляту здорових чоловіків, характерна низька генерація активних форм кисню, відсоток сперматозоїдів, в цитоплазмі яких малі, великі та дрібні темно-сині депозити відновленого дифармазану складають 15,5±4,2 %. У хворих на хронічний простатит відсоток сперматозоїдів, 50 % цитоплазми яких містять гранули диформазану, складають 75,0 % +16,3 %, що більше за показники практично здорових чоловіків і може бути фактором формування патоспермії при екскреторно-токсичному неплідді. Таблиця Показники оксидативного стресу за вмістом депозитів диформазану в сперматозоїдах еякуляту хворих на хронічний простатит та здорових донорів Групи обстежених % сперматозоїдів, які містять депозити диформазану Статист, показник Ρ 75,0±16,3