Спосіб діагностики передраку сечового міхура у хворих на хронічний цистит

Спосіб діагностики передраку сечового міхура у хворих на хронічний цистит, які проживають на забруднених радіонуклідами територіях, який включає імуногістохімічне визначення експресії протеїну р53, який відрізняється тим, що додатково проводять молекулярно-генетичний PCRSSCP аналіз гена p53, його екзотів 4-8 у тканині уротелію хворих на цистит та при наявності точкових мутацій діагностують передрак сечового міхура. Спосіб діагностики передраку сечового міхура у хворих на хронічний цистит, які проживають на забруднених радіонуклідами територіях відноситься до медицини, а саме до урології і може бути використаний для ранньої діагностики передраку сечового міхура та його профілактики. Серед хворих, які мешкають на забруднених радіонуклідами регіонах різні форми хронічного проліферативного циститу з ділянками клітинної атипії складають відповідно 94 % та 95 % з розвитком ознак променевого патоморфозу. Відома залежність між виразністю морфологічних, імуногістохімічних (AgNORпротеїни, апоптоз,р53, PCNA, bax, bcl-2) змін епітелію сечового міхура, та місцем проживання хворих і величиною показників забруднення сечі радіонуклідами Cs137. Хворі, які проживають у забруднених радіонуклідами регіонах, складають групу ризику щодо розвитку раку сечового міхура та передміхурової залози, що вказує на необхідність організації довготривалого диспансерного нагляду. Відомий спосіб діагностики раку сечового міхура [1], який полягає у імуногістохімічному визначенні експресії протеїну р53 в пухлинній тканині при перехідноклітиниому раку сечового міхура, раку простати та раку нирки. Недоліком цього способу є те, що підвищена експресія протеїну р53 визначалася лише в пухлинній тканині. Відомий також спосіб діагностики раку сечового міхура [2], прийнятий нами за прототип, який полягає у імуногістохімічному визначенні експресії протеїну р53, що є показником розвитку перехідноклітинного раку сечового міхура. Недоліком даного способу є те, що імуногістохімічні особливості уротелію визначалися лише в пухлинній тканині. В основу винаходу поставлено завдання удосконалити спосіб діагностики передраку сечового міхура у хворих на хронічний цистит, які проживають на забруднених радіонуклідами територіях шляхом визначення імуногістохімічних особливостей уротелію при передракових станах сечового міхура (різні форми хронічного проліферативного (19) UA (11) 74923 (13) (21) 2004021432 (22) 27.02.2004 (24) 15.02.2006 (46) 15.02.2006, Бюл. № 2, 2006 р. (72) Возіанов Олександр Федорович, Романенко Аліна Михайлівна, Базалицька Світлана Василівна, Виниченко Володимир Іванович, Запарін Вадим Корнійович, Забарко Лариса Борисівна (73) ІНСТИТУТ УРОЛОГІЇ АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ (56) UA, B, 51226, 15.11.2002 US, A, 5 021 551, 04.06.1991 Xu X. et al.: "A hot spot for p53 mutation in transitional cell carcinoma of the bladder: clues to the etiology of bladder cancer", Cancer Epidemiol. Miomark. Rev., 1997, vol. 4, pages 546-551 C2 1 3 74923 4 циститу з ділянками клітинної атипії та антитіла миші проти людини у робочому плоскоклітинної метаплазії уротелію, з розведенні 1:200 та матеріал залишають на 12 уротеліальною екзо- та ендофітною папіломою годин при температурі 4°С. Вторинні біотинізовані сечового міхура) та при проведенні молекулярноантитіла коня проти миші у розведенні 1:50 наногенетичного (PCR-SSCP) аналізу тену р53, а саме сять на зрізи, після чого проводять інкубацію їх з його екзонів 4 - 8 і при наявності крапкових мутацій першою порцією розчина АВС та обробляють зрізи діагностують передрак сечового міхура, ідо сприябіотинізованим тираміном у розведенні 1:125 на тиме зниженню захворюваності на рак сечового протязі 10 хвилин. Останнім кроком є нанесення міхура серед хворих, які мешкають на забруднедругої частини розчину АВС на зрізи. Зрізи фарних радіонуклідами теріторіях. бують гематоксиліном-еозином. Використовують Поставлена задача вирішується тим, що позитивний та негативний контроль. Всі зрізи спосіб діагностики передраку сечового міхура у досліджують під мікроскопом фірми „Olympus" при хворих на хронічний цистит, які проживають на збільшенні у 400 разів. На ділянках, які у сумі забруднених радіонуклідами територіях, який складають не менше, ніж 2 000 клітин, включає імуногістохімічне визначення експресії підраховують кількість клітин із забарвленим протеїну р53, згідно з винаходом, додатково проядром. Результати імуногіс-тохімічних реакцій водять молекулярно-генетичний (PCR-SSCP) дослідження експресії р53 протеїнів оцінюють із аналіз гену р53, його екзонів 4 - 8, у тканині .використанням індексів імунореактивності, що уротелію хворих на цистит та при наявності крапвизначають як відсоток позитивно забарвлених кових мутацій діагностують передрак сечового клітин серед 2000 клітин за формулою: міхура. Кількість імунопозит ивних клітин 100% Запропонований спосіб виконують таким чи2000 ном: хворим з довготривалими хронічними цистиМолекулярно-генетичний PCR-SSCP аналіз тами, що не піддаються лікуванню загальноприйгену р53, його екзонів 4-8, складається з п'яти нятими методами, у яких при цистоскопії виявлені етапів: 1 - ізоляції ДНК; 2 - очищення ДНК; 3 - прозміни слизової оболонки сечового міхура, ведення полімеразної ланцюгової реакції (PCR) характерні для лейкоплакії або папілярної пухлидля збільшення копій екзонів 8-9, 5-6 та 4; 4 - прони, поряд із клініко-лабораторним обстеженням ведення аналізу одноланцюгового виконують численну трансуретральну біопсію конформаційного поліморфізму (SSCP) із забарвстінки сечового міхура для проведення ленням сріблом; 5 - визначення послідовності імуногістохімічного дослідження експресії протеїну нуклеотидів в ДНК (3, 4). р53. Спосіб діагностики передраку сечового міхура Для визначення експресії протеїну р53 викоу хворих на хронічний цистит, які проживають на ристовують моноклональні антитіла миші проти забруднених радіонуклідами територіях був застолюдини DO-7 фірми "DAKO" (Glostrup, Данія) у сований у відділі патоморфології Інституту урології робочому розведенні 1:200 та вторинні АМН України при дослідженні 28 хворих на біотинізовані антитіла коня проти миші у хронічний цистит, які проживають на забруднених розведенні 1:50 з універсального Kit-набору фірми радіонуклідами територіях України, у 17 хворих"Vector" (Vector Laboratories, США). мешканців Києва та у 10 хворих із "чистих" регіонів Після депарафінізації у ксилолі та дегідратації віком від 49 до 92 років з використанням у спиртах матеріал у цитратному буфері інкубують загальногістологічних методів дослідження і фарв мікрохвильовій печі три рази по 5 хвилин. Блокубуванням зрізів гематоксилін-еозином. вання активності ендогеної пероксидази Розподіл хворих по групах залежно від здійснюють за допомогою розчину перекису водню радіоактивного забруднення місця проживання у метанолі у розведенні 1:9 на протязі 20 хвилин. представлений в таблиці 1. Після обробки зрізів 2% розчином сироватки коня на протязі 30 хвилин на них наносять первинні Таблиця 1 Розподіл хворих на хронічний цистит по групах залежно від радіоактивного забруднення місця проживання № 1 2 3 Групи хворих з "чистих" регіонів України (контрольна) м. Києва радіоактивне забруднених регіонів України Для екстракції ДНК відібрано епітелій сечового міхура у 17 хворих з 2 та 3 груп, які мешкають на забруднених радіонуклідами Cs регіонах України та М.Києва з інтенсивною ядерною р53 імунореактивністю (більше 10 % зафарбованих 10 17 28 Щільність забруднення ґрунту Cs (Ku/км2) Індивідуальна річна сумарна ефективна еквівалентна доза (мбер) 0,5-8 5-20 Кількість хворих 0,5 32,21 клітин), або без імуногістохімічної експресії р53, але із гістологічними змінами (дисплазія високого ступеню, CIS або ТСС) та у 9 хворих контрольної групи без передракових змін уротелію. ДНК для PCR аналізу отримують з парафінових зрізів за 5 74923 6 допомогою мікродисекції. Для цього серійні зрізи, 50 мл етанолу та 200 мл дистильованої води. аналогічні тим, що використовують для Після перетравлювання гелю у розчині, що склагістологічного дослідження, завтовшки 3-7 мкм, дався із 0,05 г содіум тріосульфату та депарафінують та висушують на повітрі. Ділянки дистильованої води протягом 1 хвилини, його досліджуваного епітелію, довжиною 3-8 мм, промивають тричі у дистильованій воді. Забарввідокремлюють тонкою голкою та вирізають під лення гелю здійснюють на протязі 30 хвилин у мікроскопом. суміші 0,175 г бензенсульфонової кислоти та 0,5 г Після мікродисекції слизового шару сечового срібла у 250 мл води, після чого гель промивають міхура уротеліальні клітини кладуть у тюби для двічі. Проявляють продукти полімеразної депарафінізації ксилолом на протязі 10 хвилин при ланцюгової реакції протягом 6 хвилин у розчині, кімнатній температурі у центрифузі при швидкості який складався із 6,25 г содіум карбонату, 250 цл 13030 обертів у хвилину, після чого промивають формальдегіду, 25 мл тіосульфату та 225 мл води. вміст тюб абсолютним етанолом та висушують. Для зупинки реакції використовують суміш з 12,5 г Перетравлювання протеїнів здійснюють протягом содіум ацетату, 28,7 г оцтової кислоти, 28,7 г 12 годин при струшуванні з додатком 0,01 моляргліцерола та 250 мл дистильованої води. Гель ного розчину фосфатного буферу (PBS) та розміщують у целофан. У всіх спостереженнях, в протеїнкінази К у концентрації 2 мг/мл. Інактивацію яких виявляють мутації, хоча б раз повторюється ензиму проводять при занурюванні тюбів у воду з PCR-SSCP аналіз з використанням незалежних температурою 94° С, на протязі 5 хвилин з наступпродуктів, наявність мутацій підтверджується пряним розташуванням на льоду протягом 5 хвилин. мим визначенням послідовності нуклеотидів. При проведенні полімеразної ланцюгової Особливу увагу при проведенні експерименту реакції (PCR) використовують стандартні праймеприділено уникненню забруднення матриці ДНК. ри фірми Bethesda Research Laboratories до PCR-реагенти утримують окремо від того місця, де екзонів 4, 5-6 та 8-9, довжиною 259, 328 та 342 знаходяться PCR-продукти. А реагенти з'єднують у нуклеотидних пари відповідно. Для екзона 5, 5'COY Template Tamer hood (COY Co., Grass Lake, TTCAACTCTGTCTCCTTCCT3', і 5'MI), оснащеною ультрафіолетовим світлом. CAGCCCTGTCGTCTCTCCAG-3'; для екзона 6, 5'Визначення послідовності нуклеотидів GCGTCTGATTCCTCACTGAT-3' і 5'здійснюють з використанням комп'ютерного проTTAACCCCTCCTCCCAGAGA-3'; для екзона 7, 5'грамного забезпечення. Для визначення 2 AGGCGCACTGGCCTCATCTT-3' і 5'статистичної достовірності використовують TGTGCAGGGTGGCAAGTGGC-3'; для екзона 8, 5'тест. TTCCTTACTGCCTCTTGCTT-3' і 5'Дані морфологічного дослідження пояснюють AGGCATAACTGCACCCTTGG-3'. ілюстративними матеріалами. Для приготування складного гелю (5 % На фіг. 1 представлена випадково виявполіакріламід 0,25 % агароза) розмірами 210 х 400 лена папілярно-інвазивна уротеліальна карцинома .х 0,4 мм використовують 5 мл 50 % акріламіду в у хворого із забрудненого радіонуклідами регіону. суміші з 5 мл 50 % гліцерола та 15 мл Гематоксилін-еозин. Х 180. дістильованої води. Суміш інкубують протягом 2 На фіг. 2 - висока імуногістохімічна експресія хвилин у мікрохвильовій печі при температурі 100° протеіназ р53 в уротелії сечового міхура при С. Адекватний об'єм 0,5 % агарози фірми BioRad хронічному непроліферативному циститі у хворого (Hercules, CA, USA) у розчині фосфатного буферу з забрудненого радіонуклідами регіону. Х 200. підігрівають до 100° С та охолоджують до 30°С. При гістологічному дослідженні біоптатів сечоСуміш розчинів поліакріламіду та агарози, які гового міхура у всіх спостережених груп хворих із тують разом з 330 ë 10 % розчину амонію перзабруднених радіонуклідами територій України та сульфату та 30 ë тетраметиленаміду заливають м. Києва визначають різні форми хронічного проліферативного циститу: гнізда Бруна, кистозв апарат "Sequi - Gen" фірми BioRad (Hercules, CA, ний цистит, поля плоскоклітинної або залозистої, USA). Гель залишають протягом 12 годин при часто кишкової, метаплазії, що нерідко кімнатній температурі. поєднувалися між собою. Для цих випадків харакПри проведенні аналізу одноланцюгового терними є численні крововиливи у підслизовому конформаційного поліморфізму (SSCP) 5 ë шарі, дилятація судин та ангіоматозні судинні продуктів, які отримують для кожного із екзонів 4, зміни, а також зони склерозу і фіброзу, що в 5-6 та 8-9 при PCR реакції, змішують з трьома цілому можна охарактеризувати як променевий об'ємами "стоп" буферного розчину, до складу патоморфоз хронічного циститу. якого входять 98 % розчин формаміду, 10 У всіх спостереженнях досліджуваних 3 та 2 мілімолярний розчин їдкого натру, 20 мілімогруп, за виключенням 3 хворих із 45, визначають лярний розчин фосфатного буферу, 0,15 % брочисленні зони дисплазії, що становить 95 % та 94 мофенол блакитний та 0,05 % розчин ксилен циа% відповідно. Крім того, у 22 хворих - 16 хворих 3 нолу FF. Після денатурації отриманої речовини групи та 6 хворих 2 групи, визначають ділянки раку протягом 10 хвилин при температурі 90° С, її закаin situ (CIS), що становить 57 % та 35 % пують в гель. Гель розташовують у буферному відповідно. Крім того, випадково верифіковані 2 розчині та проводять електрофорез при напрузі 40 маленькі уротеліальні карциноми (одна папілярноW протягом трьох годин при температурі 4°С . інвазивна, а друга- інвазивна) (Фіг. 1). Після електрофорезу, на гель протягом 30 При цьому, в уротелії пацієнтів контрольної хвилин наносять розчин, який фіксує гель, та групи кількість випадків хронічного складається із 1,5 г бензенсульфонової кислоти, проліферативного циститу становить 6 спостере 7 74923 8 жень, у двох із яких визначали ділянки дисплазії імуногі-стохімічної експресії протеїну р53 наглядно уротелію сечового міхура низького ступеню. В демонструє високу експресію протеїну р53 у інших випадках передракових та ракових змін в уротелії сечового міхура хворих з забруднених уротелії виявлено не було, хоча ознаки запалення радіонуклідами територій України та м. Києва і спостерігали, як в уротелії, так і в підслизовому відсутність її у хворих із трьох контрольних груп шарі. (Фіг.2). Молекулярно-генетичний аналіз проведено у Результати мутаційного аналізу гену наведено 17 хворих-мешканців забруднених радіонуклідами у таблиці 2. територій України. Порівняльний аналіз показників Таблиця 2 Мутаційний аналіз гену р53 в уражених ділянках уротелію пацієнтів, що мешкають на забруднених радіонуклідами територіях України № Вік/ група 1 2 3 4 5 6 57/1 69/1 60/П 74/1 67/1 78/II 7 8 9 10 11 12 69/1 68/1 66/1 63/1 73/1 68/1 13 66/1 14 63/1 15 68/1 16 Дата дослідження 02.1997 05.1996 05.1995 11.1996 03.1996 05 1996 07.1997 12.1994 07.1996 11.1994 01.1995 02.1997 05.1995 07.1997 03.1995 01.1997 07.1997 07.1996 08.1997 69/П 02.1997 Зразок Біопсія Біопсія Біопсія Біопсія Біопсія Біопсія Сеча Біопсія Біопсія Біопсія Біопсія Біопсія Біопсія Сеча(58СР) Біопсія Біопсія . Біопсія сеча(ЗСР) Біопсія ce4a(SSCP) а d 70/1 Дисплазія' Дисплазія Дисплазія CISb CIS Дисплазія Дисплазія Дисплазія Дисплазія CIS Інвазивна ТСС ' CIS Дисплазія CIS Дисплазія Дисплазія Дисплазія 05.1995 Біопсія Біопсія 08.1997 17 Гістологічний діагноз Дисплазия CIS Сеча Екзон Немає Немає Немає Немає Немає N.E.' Немає Немає Немає 7 7 5 N.E. 5 7 7 7 7 7 7 5 7 7 7 5 7 4 6 Кодон Мутації гену р53 Зміни Зміни основ послідовності AMK' Переміщення нуклеотидів 251 245 158 АТС СТС GGC AGC CGC CAC Ile Leu Gly Ser Arg His A C G A/CpG G A/CpG 175 245 245 245 245 245 245 154 245" 254'1 248 158 248 125" 2116 CGC GGC GGC GGC GGC TGC AGC AGC AGC AGC Arg Gly Gly Gly Gly Cys Ser Ser Ser Ser C G G G G GGC GGC GGC ATC CGG CGC CGG ACG ACT AGC GGT AGC ACC TGG CAC TGG ATG ATT Gly Gly Gly Ile Arg Arg Arg Arg Thr Ser Gly Ser Thr Trp His Trp Met He Т/CpG A/CpG A/CpG A/CpG A/CpG G /CpG G Т/nonCpG G A/CpG T C C Т/CpG G A/CpG C Т/CpG C /CpG C T/non-CpG виразність дисплазії середня-сильна. bКарцинома т situ. сНеоцінювалася через недостатність кількості PCR зразків. тандемні мутації на ідентичних алелях. еАМК - амінокислота. У зонах CIS та клітинної атипії уротелію більшості спостережень (9 із 17 пацієнтів -53 %), що підлягали молекулярно-генетичному аналізу, визначені одна і більше крапкових мутацій гену р53, як в поодиноких так й в декількох зразках у одного і того ж пацієнта, що забирали в різні часи. У трьох пацієнтів при дослідженні в різні часи різних біоптатів, або біоптатів і сечі, визначені ідентичні мутації, що підтверджує їх клональну спорідненість, тобто наявність мутованих клонів в уротелії з десквамацією у сечу значної кількості ушкоджених клітин. Всі виявлені мутації гену, окрім одної, де було визначено ураження різних екзонів (кодон 154, GGC (Gly) на GGT (Gly), є поодинокими заміщеннями основних пар, при цьому відсутні делеції та інсерції. Специфічні мутації визначені у 11 із 15 хворих (73 %) і є поодинокими трансцизіями основных пар G:C на А: Т у CpG динуклеотидів (кодони 158, 245, 248) в екзонах 4, 5, 6, 7. З метою виявлення змін в послідовності нуклеотидів між колонами 245 - 254 екзона 7, де знайдені мутації у 9 із 15 випадків, утворені специфічні праймери для цієї ділянки (5'ACTACATGTGTAACAGTTCC-3' і 5'TCCTGACCTGGAGTCTTCCA-3'), які продукували PCR-фрагмент довжиною 86 bp (основних пар). На екстрагованих ДНК уротелію 9 пацієнтів, які проживають у “чистих” регіонах (група 1 - контрольна), проведений PCR-SSCP аналіз показав, що жодного аномального бенду не було виявлено. За результатами проведення молекулярногенетичних досліджень визначено, що висока імуногістохімічна експресія протеїну р53 в уротелії сечового міхура відповідає мутаціям гену р53 ДНК. Наводимо приклади практичного застосування запропонованого способу. Приклад 1. Хв. Л.А., і.х. № 164, 68 р., мешканець м.Києва. Поступив в клініку 20.01.2003 р. з діагнозом: гиперплазія простати, хр.цистит. Проведена численна біопсія стінки сечового міхура. Встановлений гістологічний діагноз: хр.проліферативний кистозно-фолікулярний цистит. 9 74923 10 Дослідження біоптату сечового міхура протгодтеіе кових мутацій гену р53, що сприятиме попередза запропонованим способом та виявлено високу женню та зниженню захворюваності на рак сечоімуногістохімічну експресію протеїну р53 уротелію вого міхура населення, яке проживає на забрудсечевого міхура. Молекулярно-генетичний аналіз нених радіонуклідами територіях. гену р53 виявив численні крапкові мутації в екзоДжерела інформації, прийняті до уваги при нах 4-8. Хворому призначене профілактичне експертизі лікування цитостатичними препаратами. Через 1. Sinik Z., Alkibay Т., Bozkirli I. Nuclear р53 місяць проведене контрольне дослідження з overexpression in bladder, prostate and renal carciцитологічним аналізом аспірату сечі. nomas. // Int. J. Urol. - 1997. - V. 4. - P. 546-551. Проліферативних та диспластичних змін в уротелії 2. A hot spot for р53 mutation in transitional cell сечового міхура не виявлено. carcinoma of the bladder: clues to the etiology of Таким чином, застосування запропонованого bladder cancer /Xu X., Slower M.J., Reid I.N. et al. способу у хворих з довготривалими хронічними //Cancer Epide-miol. Miomark. Rev. - 1997. - V. 6. циститами, що не піддаються лікуванню загальноP. 611-616 (прототип). прийнятими методами, у яких при цистоскопії 3. Nomiyama K., Nomiyama M. Critical concenвиявлені зміни слизової оболонки сечового міхура, trations of "unbound" cadmium in the rabbit renal corхарактерні для лейкоплакії або папілярної пухлиtex //Experientia. - 1986. - V. 42. - P. 149. ни, поряд із клініко-лабораторним обстеженням 4. ЕРА. U.S. Environmental Protect Agency: Part необхідно виконувати численну трансуретральну II. Federal Register. - 1990. -V. 55.-P. 31227-31229. біопсію стінки сечового міхура на виявлення крап Комп’ютерна верстка М. Клюкін Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601