Спосіб підвищення фагоцитарної активності нейтрофілів після гіпотермічного зберігання

Реферат: Спосіб підвищення фагоцитарної активності нейтрофілів після гіпотермічного зберігання передбачає використання реабілітуючого середовища, що містить препарат крові великої рогатої худоби. Як такий препарат використовують низькомолекулярну фракцію кордової крові до 5 кДа у концентрації 0,15 мг/мл. UA 76533 U (54) СПОСІБ ПІДВИЩЕННЯ ФАГОЦИТАРНОЇ АКТИВНОСТІ НЕЙТРОФІЛІВ ПІСЛЯ ГІПОТЕРМІЧНОГО ЗБЕРІГАННЯ UA 76533 U UA 76533 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі кріобіології і кріомедицини і може бути використана в клінічній трансфузіології. Відомий спосіб підвищення фагоцитарної активності нейтрофілів після гіпотермічного зберігання із застосуванням середовища, яке містить буфер HEPES рН 7,4, бичачий альбумін, глюкозу, NaCl, KCl [1]. Недоліком цього способу є недостатньо високий рівень підвищення фагоцитарної активності нейтрофілів. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб підвищення фагоцитарної активності нейтрофілів після гіпотермічного зберігання, в якому використовують реабілітуюче середовище, що містить 1 мг/мл препарату Актовегіну (Nycomed, Австрія), який є депротеїнізованим дериватом крові молочних телят з молекулярною масою до 5 кДа [2]. Недоліком цього способу є недостатньо високий рівень підвищення показників фагоцитарної активності нейтрофілів (табл. 2). В основу корисної моделі поставлено задачу створити такий спосіб підвищення фагоцитарної активності нейтрофілів після гіпотермічного зберігання, в якому би, шляхом зміни складу реабілітуючого середовища, забезпечувалась можливість більш ефективного підвищення фагоцитарної активності нейтрофілів. Поставлена задача вирішується тим, що в способі підвищення фагоцитарної активності нейтрофілів після гіпотермічного зберігання, який передбачає використання реабілітуючого середовища, що містить препарат крові великої рогатої худоби, згідно з корисною моделлю, як такий препарат використовують низькомолекулярну фракцію кордової крові (ФКК) корів до 5 кДа у концентрації 0,05-1,5 мг/мл. Використання ФКК у концентрації 0,15 мг/мл дозволяє підвищити показники фагоцитарної активності нейтрофілів після гіпотермічного зберігання у порівнянні з реабілітуючим середовищем, що містить Актовегін. Спосіб пояснюється прикладом. Приклад Виділення фракції з компонентами молекулярної маси до 5 кДа з цільної кордової крові корів проводили методом ультрафільтрації [3] з використанням мембранного модуля фірми "Sartorius" (Німеччина). Фагоцитарну активність деконсервованих нейтрофілів оцінювали за наступними показниками: відсоток фагоцитуючих нейтрофілів - фагоцитарний індекс (ФІ), середня кількість мікробних тіл на один нейтрофіл фагоцитарне число (ФЧ) після 45 і 120 хв інкубації, а також коефіцієнт завершеності фагоцитозу (КФЧ) - співвідношення фагоцитарного числа після 45 хв інкубації до фагоцитарного числа через 120 хв інкубації, що характеризує переварювальну активність нейтрофілів. Після гіпотермічного зберігання до 100 мкл лейкоцитарної суспензії додавали 20 мкл мікробної суспензії Staphylococcus aureus, після чого інкубували у термостаті при температурі +37 °C протягом 45 і 120 хв та робили мазки за Романовським [4]. Встановлено, що після гіпотермічного зберігання всі показники фагоцитозу зменшувались, і особливо КФЧ, який до зберігання складав 1,30±0,01 відн. од., після зберігання 1,06±0,02 відн. од. (табл. 1). Після вивчення фагоцитарних показників деконсервованих нейтрофілів (ФІ, ФЧ, КФЧ) до 100 мкл суспензії деконсервованих лейкоцитів додавали ФКК в різних концентраціях: 0,05 мг/мл, 0,15 мг/мл, 1,5 мг/мл, 3,0 мг/мл. Встановлено, що використання ФКК в реабілітуючому середовищі у концентрації 0,15мг/мл збільшує КФЧ в 1,8 разу у порівнянні з контролем і прототипом, а ФЧ у 1,7 разу у порівнянні з контролем і в 2 рази у порівнянні з прототипом (табл. 1, 2). Встановлено, що низькомолекулярна фракція кордової крові в концентрації 0,15 мг/мл має максимальну стимулюючу дію на поглинальну і переварювальну здатність деконсервованих нейтрофілів. Подальше збільшення концентрації ФКК призводило до зменшення фагоцитарної активності деконсервованих нейтрофілів. Метаболічну активність або здатність до генерації активних форм кисню нейтрофілами, після додавання ФКК у концентрації 0,15-3,0 мг/мл оцінювали за індукованим НСТ тестом [5] реакцією відновлення нітросинього тетразолію при стимуляції клітин стафілококом (табл. 1, 2). Відзначений той факт, що додавання ФКК до реабілітуючого середовища у концентрації 0,15 мг/мл стимулює кисеньзалежний метаболізм після гіпотермічного зберігання. Так, до гіпотермічного зберігання відсоток диформазан-позитивних клітин складала 80,18±2,6 %, після зберігання - 71,96±3,2 %. Відсоток диформазан-позитивних клітин після використання Актовегіну у концентрації 0,15 мг/мл, складала 69,67±1,45 %. Після використання ФКК у концентрації 0,15 мг/мл відсоток діформазан-позитивних клітин складав 85,36±1,56, що в 1,2 разу більше у порівнянні з прототипом (табл. 1, 2). 1 UA 76533 U Таблиця 1 Фагоцитарна активність нейтрофілів після гіпотермічного зберігання і використання ФКК у складі реабілітуючого середовища Показники фагоцитарної активності нейтрофілів Умови експерименту Лейкоцитарна маса до зберігання (натив) Лейкоцитарна маса після гіпотермічного зберігання (контроль) 0,05 мг/мл 0,15 Контроль мг/мл +ФКК 0,30 (вміст у мг/мл середовищі 1,50 інкубації) мг/мл 3,00 мг/мл ФІ, % (45 хвилин інкубації) 60,52±2,32 Кількість НСТФИ, % (120 ФЧ, абс. од. ФЧ, абс. од. КФЧ, відн. позитивних хвилин (45 хвилин (120 хвилин нейтрофілів, од. інкубації) інкубації) інкубації) % 58,56±1,17 15,37±1,32 11,79±1,02 42,71±1,03* 34,78±0,86* 11,49±0,71 10,79±0,61 1,06±0,02* 71,96±3,20 40,20±2,33 37,04±1,70 12,62±1,10 11,01±0,88 41,46±1,95 36,85±2,86 19,19±1,28** 39,08±4,37 34,71±3,84 9,82±1,63 10,38±2,68 1,02±0,09 81,79±1,69** 36,77±4,37 42,04±3,77 8,67±0,94 9,34±0,93 0,93±0,04 83,11±1,34** 10,52±0,94 11,23±1,27 0,96±0,06 82,54±1,30** 39,92±1,86 49,23±1,75** 1,30±0,03 1,15±0,05 80,18±2,67 73,32±2,01 9,99±0,57 1,92±0,08** 85,36±1,56** * - у порівнянні з нативом; ** - у порівнянні з контролем Таблиця 2 Фагоцитарна активність нейтрофілів після гіпотермічного зберігання і використання актовегіну у складі реабілітуючого середовища Показники фагоцитарної активності нейтрофілів Умови експерименту Лейкоцитарна маса до зберігання (натив) Лейкоцитарна маса після гіпотермічного зберігання (контроль) ФІ, % (45 хвилин інкубації) 60,52±2,32 ФИ, % (120 ФЧ, абс. од. ФЧ, абс. од. хвилин (45 хвилин (120 хвилин інкубації) інкубації) інкубації) Кількість НСТКФЧ, відн. позитивних нейтрофілів, од. % 58,56±1,17 15,37±1,32 11,79±1,02 1,30±0,03 80,18±2,67 42,71±1,03* 34,78±0,86* 11,49±0,71 10,79±0,61 1,06±0,02* 71,96±3,20 2 UA 76533 U Продовження таблиці 2 0,05 мг/мл 0,15 Контроль мг/мл +Актовегін 0,30 (вміст у мг/мл середовищі 1,50 інкубації) мг/мл 3,00 мг/мл 41,11±2,64 36,30±2,18 11,03±1,00 9,76±0,93 1,13±0,06 70,64±1,88 37,84±2,30 34,17±3,05 9,19±0,46 8,68±0,68 1,07±0,05 69,67±1,45 44,26±4,25 34,05±1,18 18,55±1,13** 16,66±0,73** 1,11±0,05 68,76±2,13 50,12±3,62 38,59±3,48 15,13±1,69 9,84±1,01 45,74±4,09 42,36±3,11 11,66±1,22 11,42±1,13 1,54±0,06** 79,78±1,54 1,02±0,03 77,14±1,61 * - у порівнянні з нативом; ** - у порівнянні з контролем 5 10 15 Джерела інформації: 1. Е. Decleva, R. Menegazzi, S. Busetto, P. Patriarca, P. Drs. Common methodology is inadequate for studies on the microbicidal activity of neutrophils // Journal of Leucocite Biology, 2006. - Vol. 79. - P. 87-94. 2. Актовегин. Новые аспекты клинического применения. / Под ред. С.А. Румянцевой. - М, 2002. - С. 37-42. 3. Брок Т. Д. Мембранная фильтрация / под ред. Б.В. Мчедлишвили. - Москва: Мир, 1987. С. 348-377. 4. Подопригора Г.И., Андреев В.Н. Современные методы изучения фагоцитарной активности лейкоцитов in vitro // Журн. микробиолюгии, эпидемиологии и иммунологии.-1976. № 1. - С. 19-25. 5. Герасимов И.Г., Калуцкая О.А. Кинетика реакции восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами крови человека // Цитология.-2000. - Т. 42, №2. - С. 160-165. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 Спосіб підвищення фагоцитарної активності нейтрофілів після гіпотермічного зберігання, який передбачає використання реабілітуючого середовища, що містить препарат крові великої рогатої худоби, який відрізняється тим, що як такий препарат використовують низькомолекулярну фракцію кордової крові до 5 кДа у концентрації 0,15 мг/мл. Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3