Спосіб визначення цитотоксичної активності поліморфноядерних нейтрофілів після радіойодотерапії хворих на рак щитовидної залози

Спосіб визначення цитотоксичної активності поліморфноядерних нейтрофілів після радіойодотерапії хворих на рак щитовидної залози, що включає проведення інкубації лейкоцитів периферичної крові з еритроцитарними клітинамимішенями і оцінку реакції лізису еритроцитів з використанням реактиву, який посилює оптичну щільність проб, з подальшим спектрофотометричним визначенням кількості гемоглобіну, який вивільнився в процесі інкубації, який відрізняється 3 його іншими клітинами. Окрім цього, виконання методики потребує необхідності дотримуватись специфічних умов техніки безпеки для дослідника та навколишнього середовища, що збільшує її затратність. Відомий спосіб нерадіометричного визначення цитотоксичної активності ПЯН із застосуванням вимірювання вивільненого гемоглобіну з алогенних еритроцитарних клітин-мішеней, які, як відомо, є інертними клітинами [8]. Проте, у цьому способі проводилось визначення цитотоксичної активності ПЯН щурів. Оцінку лізису еритроцитів проводили фотоелектроколориметрично, визначаючи кількість гемоглобіну у супернатанті, тобто ту кількість гемоглобіну, який вивільнився з лізованих лейкоцитами еритроцитів. Відомий спосіб нерадіометричного визначення цитотоксичної активності клітин із застосуванням спектрофотометрії та визначення вивільненого з клітин-мішеней гемоглобіну із застосуванням реактиву метолу для підвищення оптичної щільності вимірювальних проб [9]. Даний спосіб є чутливим, але в ньому проводиться визначення цитотоксичної активності інших ефекторів вродженого імунітету NK-клітин, а не ПЯН, з використанням ксеногенних клітин-мішеней (еритроцити барана, курей та ін.). Також відомий і спосіб експериментального нерадіометричного визначення клітинноопосередкованої цитотоксичності лейкоцитів, прийнятий за прототип, що полягає в інкубації лейкоцитів з клітинами-мішенями (алогенні еритроцити) та оцінці реакції, яку проводять з використанням тетраметилбензидину (ТМБ) та подальшим визначенням гемоглобіну, що вивільнився в процесі лізису еритроцитів [10]. Однак у прототипі визначається цитотоксична активність загальної популяції сенсибілізованих лейкоцитів, до складу яких входять лімфоцити, моноцити та ін., а не цитотоксична активність ПЯН, що не дозволяє конкретизувати визначення. Крім того, застосовується високотоксичний канцероген - ТМБ, що обмежує використання цього способу в клінічній лабораторії. В основу даної корисної моделі поставлена задача вдосконалити спосіб визначення цитотоксичної активності поліморфноядерних нейтрофілів після радіойодотерапії хворих на рак щитовидної залози шляхом дослідження мітоген-індукованої цитотоксичної активності цих клітин проти ксеногенних еритроцитарних клітин-мішеней та спектрофотометричної оцінки реакції із застосуванням безпечнішого, дешевшого та доступного реактиву, що дозволить використовувати спосіб в клінічній лабораторії та підвищить точність, інформативність та ефективність визначення цитотоксичної активності ПЯН. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, що включає проведення інкубації лейкоцитів периферичної крові з еритроцитарними клітинами-мішенями і оцінку реакції лізису еритроцитів з використанням реактиву, який посилює оптичну щільність проб, з подальшим спектрофотометричним визначенням кількості гемоглобіну, який вивільнився в процесі інкубації, згідно з да 63632 4 ною корисною моделлю, спочатку виділяють поліморфноядерні нейтрофіли з периферичної крові донорів та хворих на рак щитовидної залози напередодні та після радіойодотерапії, інкубують з ксеногенними еритроцитами в присутності мітогену, потім клітини відмивають і до осаду додають лізуючий розчин та реактив метол і при виявленні істотного збільшення активності поліморфноядерних нейтрофілів крові проти ксеногенних еритроцитів у "повному" живильному середовищі з мітогеном ліпополісахаридом роблять висновок про чутливість способу та ефективність визначення, а при виявленні значного відхилення цитотоксичної активності поліморфноядерних нейтрофілів у хворих на рак щитовидної залози після опромінення йодом-131 від вихідного значення та від показника у донорів роблять висновок про порушення цитотоксичної активності цих гранулоцитів. Таке рішення було прийняте після проведення серії експериментальних досліджень з підбору ксеногенних клітин-мішеней (еритроцити мишей лінії СВА, щурів лінії Wistar), мітогенів - ліпополісахарид (ЛПС), конканавалін-А (Кон-А), та їхніх концентрацій для визначення мітогенопосередкованої цитотоксичної активності ПЯН у донорів та у хворих на ДРЩЗ. Так, наприклад, встановлено, що у хворих на ДРЩЗ після РЙТ спонтанна активність ПЯН проти еритроцитів мишей лінії СВА складає (17,4±2,3) %, індукована ЛПС - (27,1±3,3) %, індукована Кон-А - (28,8±2,8)%, а проти еритроцитів щурів лінії Wistar становить (20,4±3,2) %, індукована ЛПС - (24,5±2,3) %, індукована Кон-А - (35,3±3,6) %. Це свідчить, що еритроцити мишей лінії СВА та щурів лінії Wistar є чутливими мішенями для визначення стимульованої цитотоксичної активності ПЯН периферичної крові людини. Відомо, що взаємодія ПЯН з еритроцитами в присутності ЛПС відбувається за допомогою рецепторів CD 14, які індукують активність ПЯН, та молекул адгезії CD11b/CD18, які забезпечують тісний контакт між клітинами та подальшу активацію ПЯН [11]. Мітоген Кон-А посилює міжклітинну взаємодію та сприяє цитолізу [5]. Лізис клітин-мішеней ПЯН здійснюють за участі активних форм кисню. В серії досліджень, проведених авторкою, з'ясовано, що ЛПС є оптимальним стимулятором цитотоксичності, оскільки, на відміну від Кон-А, не дає гемаглютинації під час інкубації клітин, яка може зменшувати точність спектрофотометричного вимірювання результатів. Також встановлено, що ЛПС ефективно індукує реакцію ПЯН проти еритроцитарних клітин-мішеней в концентрації 10-100 мкг/мл. Все це дало змогу отримати результати, які показали, що у групі донорів (середній вік (30,9±1,7) року) ЛПС-індукована активність ПЯН проти еритроцитів мишей становить (47,6±2,7) %. Це достовірно вище в 1,4 разу (Р